雌激素对纵隔子宫电切术后宫腔纤维化的影响*

高丽，池余刚，何萍，雷丽，任春燕，孟莹

（1.重庆市妇幼保健院 妇科，重庆 401147；2.重庆医科大学附属第二医院 妇科，重庆 400010）

纵隔子宫系两侧副中肾管融合后纵隔吸收受阻所致，是最常见的先天性子宫畸形，约40%纵隔子宫患者合并有不孕、产科相关并发症及复发性流产等不良妊娠史[1]。宫腔镜下纵隔子宫电切除术是目前最安全、有效的手术方式。有研究证实，宫腔镜下纵隔子宫电切除术术后可提高妊娠结局[1-2]。然而纵隔子宫电切除术术后有发生宫腔粘连的可能，宫腔粘连可导致不孕、流产等并发症。ROY等[3]认为，纵隔子宫电切除术术后给予雌激素并不能有效预防宫腔粘连的形成[3]。本文通过研究转换生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）及结缔组织生长因子（connective tissue growth factor, CTGF）的表达，探讨雌激素对纵隔子宫电切除术术后宫腔纤维化的影响。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年1月—2017年6月重庆市妇幼保健院收治的110例行纵隔子宫电切除术的纵隔子宫患者（包括完全纵隔子宫和不完全纵隔子宫），分为实验组58例（雌激素治疗：补佳乐2 mg/次，2次/d，共21 d；最后10 d加用地屈孕酮10 mg/次，2次/d）[4]和对照组52例（不使用雌激素治疗）。纳入标准：①术前性激素6项检查正常；②术前半年未使用激素类药物；③术前常规检查及症状提示无感染征象；④乳腺检查无激素用药禁忌证；⑤无子宫内膜原发或继发性疾病；⑥无内分泌、高血压、肾脏疾病、糖尿病、甲状腺功能亢进症及导致血管病变的其他合并症；⑦宫腔镜术中证实术前无宫腔粘连。排除标准：①既往有宫腔镜手术操作史；②宫腔镜证实术前有宫腔粘连；③术后未按规定服药及定期复查；④年龄＞40岁。本研究通过医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 方法

手术采用超声监测下宫腔镜下纵隔子宫电切除术，均为静脉麻醉。纵隔子宫电切除术术后1个月复查宫腔镜，经患者同意术中取少许宫内膜组织，采用美国生育学会（American Fertility Society, AFS）评分标准[5]，对宫颈情况进行AFS评分。评分内容包括粘连范围、粘连类型及月经情况：0分为痊愈；1～4分为预后良好；5～8分为预后欠佳；9～12分为预后不良。

1.3 免疫组织化学染色

具体操作步骤按照免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）说明书进行，一抗浓度TGF-β及CTGF均为1∶100。采用Image J软件处理图片，采用染色强度与阳性细胞百分率积分（积分等于2项评分相加除以2）评价TGF-β和CTGF的表达。染色强度评分：染色弱评为1分；染色强度中等评为2分；染色强（深棕色）评为3分。阳性细胞百分率评分：阳性率1%～10%计1分；阳性率11%～25%计2分；阳性率26%～50%计3分；阳性率51%～75%计4分；阳性率76%～100%计 5分[6]。

1.4 RT-PCR

组织处理完成后，用Trizol提取总RNA，按照PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser说明书将总RNA（1μg）逆转录成互补DNA。TGF-β引物序列，正向引物：5'-CTTCATGGTGGCTTTCTTCAA-3’；反 向 引 物：5'-CACTCCCCCTCACAGTAGTAG-3'，长度为264 bp[6]。CTGF引物序列，正向引物：5'-GCTCCCTGCATCTTCGGTGGTAC-3’；反向引物：5'-GGCAGTTGGCTCTAATCATAGTTGGG-3'，长度为298 bp[7]。PCR操作参照SYBR® Premix Ex Taq TMⅡ说明书。采用2-△△CT法计算TGF-β及CTGF mRNA的相对表达量。

1.5 统计学方法

数据分析采用GraphPad Prism 7.0统计软件。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较用t检验；计数资料以率（%）表示，比较用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组临床资料比较

两组年龄、BMI、不孕率、不完全纵隔率、完全纵隔率、合并阴道纵隔率及宫腔粘连发生率比较，经t或χ2检验，差异无统计学意义（P＞0.05）。见 表1。

2.2 纵隔子宫电切除术术后1个月子宫状况

纵隔子宫电切除术术后1个月宫腔镜检查显示子宫不完全纵隔患者术后宫腔形态恢复满意；子宫完全纵隔患者术后形成宫底粘连。见图1。

2.3 两组纵隔子宫电切除术术后宫腔粘连的AFS评分比较

实验组发生宫腔粘连3例（5.2%），AFS评分（3.3±1.3）分。其中，2例AFS评分2分（预后良好），1例评分6分（预后欠佳）。对照组发生宫腔粘连1例，AFS评分2分。对照组和实验组TCRS术后宫腔粘连发生率分别为1.9%和5.2%，经χ2检验，差异无统计学意义（χ2=0.159，P=0.690）。两组AFS评分比较，经t检验，差异无统计学意义（t=1.070，P=0.285）。

表1 两组临床资料比较

图1 宫腔镜下纵隔子宫电切除术术前后对比

2.4 两组子宫内膜组织中TGF-β及CTGF蛋白的表达

两组TGF-β及CTGF蛋白在子宫内膜腺上皮的细胞浆和细胞核上均有表达，且在子宫内膜间质细胞上也有表达。实验组与对照组TGF-β蛋白相对表达量分别为（2.81±0.13）和（2.85±0.14），经t检验，差异无统计学意义（t=0.237，P=0.812）。实验组与对照组CTGF蛋白相对表达量分别为（2.56±0.12）和（2.73±0.12），经t检验，差异无统计学意义（t=0.933，P=0.352）。见图2、3。

图2 两组TGF-β和CTGF蛋白的表达 （免疫组织化学染色×200）

图3 两组TGF-β和CTGF蛋白相对表达量比较 （±s）

2.5 两组TGF-β及CTGF mRNA的表达

RT-PCR结果显示，实验组与对照组TGF-β mRNA相对表达量分别为（3.59±0.10）和（3.41± 0.07），经t检验，差异无统计学意义（t=1.446，P=0.151）。实验组与对照组CTGF mRNA相对表达量分别为（2.79±0.05）和（2.86±0.058），经t检验，差异无统计学意义（t=0.938，P=0.350）。见 图4。

图4 两组TGF-β及CTGF mRNA相对表达量比较 （±s）

3 讨论

宫腔镜下纵隔子宫电切除术是纵隔子宫治疗的金标准，是目前可以单纯经宫腔镜手术矫正子宫畸形的唯一方法[8]。宫腔镜纵隔子宫电切除术术后宫腔粘连发生率为5.3%～12.0%[9]，是较常见的并发症。术后宫腔粘连的预防是不可忽视的问题，XIAO等[10]将纵隔子宫电切除术术患者随机分为4组：第1组术后使用雌激素；第2组术中安置宫内节育器；第3组术中安置4 ml宫腔水囊，术后宫腔水囊保留5 d；第4组不使用以上3种辅助治疗方式。分别于术后第1和3个月再次分别行宫腔镜检查，评估宫腔情况，最后统计结果提示术后使用雌激素、安置宫内节育器及宫腔水囊对降低纵隔子宫电切除术术后粘连发生率并无作用[10]。

宫腔粘连是指各种因素引起的子宫内膜损伤导致宫腔部分或全部封闭而发生的一系列综合征，以月经量减少、闭经、流产及不孕等为主要表现。各类刮宫手术是引起宫腔粘连的主要原因，占宫腔粘连危险因素的75%，其中以人工流产术和自然流产术后刮宫为主，各类宫腔镜检查引起宫腔粘连占各类危险因素的9%[11]。宫腔镜下宫腔粘连分离术后粘连的总体复发率为3.1%～23.5%，而重度粘连复发率为20.0%～62.5%[11]。现研究结果表明，粘连分离术后使用雌激素可降低粘连复发率，提高妊娠率[12]。本研究中粘连发生率低于以上文献报道的发生率。使用雌激素与否的粘连发生率比较无差异，提示雌激素并不能降低纵隔子宫电切除术术后粘连的发生率，进而检测TGF-β及CTGF的表达情况以探讨相关发生机制。

TGF-β是目前公认的且研究最深入的促纤维化因子，现发现哺乳动物TGF-β有TGF-β1、TGF-β2及TGF-β3，其中TGF-β1活性最强。TGF-β主要是通过与特异性受体结合后，激活Smad、丝裂原活化蛋白激酶、肿瘤坏死因子受体相关因子-4等多条信号途径产生效应，以TGF-β1/Smad信号通路的作用最显著[13]。目前认为，CTGF是TGF-β在调节纤维组织形成中的下游调节因子[14]，TGF-β的致纤维化功能通过CTGF实现。有学者通过测定宫腔粘连患者子宫内膜中TGF-β1和CTGF的表达，发现宫腔粘连患者子宫内膜中TGF-β1和CTGF的表达较正常子宫内膜高，预测TGF-β和CTGF通过NF-κB信号通路在宫腔粘连中扮演重要角色[7]。LI等[15]通过建立宫腔粘连动物模型发现，抑制Sp1-TGF-β1/Smad-CTGF信号途径可达到抑制子宫内膜纤维化目的，降低宫腔粘连形成率。也有学者发现，通过应用雌激素可降低TGF-β的表达，减少粘连形成，所以宫腔粘连术后应用雌激素可减低粘连的复发率[16]。赵刚等[17]研究发现，纵隔子宫电切除术术后预后不良组中TGF-β1表达增强，推测TGF-β参与纵隔子宫电切除术术后不良结局的发生。本文对比纵隔子宫电切除术术后雌激素使用与否的宫腔粘连发生率、TGF-β及CTGF的表达，发现对照组与实验组术后宫腔粘连的发生率比较无差异，这与XIAO等[10]研究结果一致，且TGF-β及CTGF的表达比较无差异。

综上所述，通过实验推测雌激素不能改变纵隔子宫电切除术术后纤维化发生，可能是因为雌激素不能改变纵隔子宫电切除术术后致纤维化因子（TGF-β/CTGF）的表达所致，这为研究纵隔子宫电切除术术后粘连的发生机制提供新的思路。但仍需要扩大样本量和加强长期随访工作以进一步验证。