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血管内皮生长因子促进根尖周囊肿骨吸收

2020-04-09刘春燕张旗

实用口腔医学杂志 2020年4期
关键词:颌骨骨细胞纤维细胞

刘春燕 张旗

根尖周囊肿是颌骨内常见的牙源性囊肿,约占牙源性囊肿发病率的54.6%[1]。根尖周囊肿多由根管内或根尖周部位的感染造成根尖区炎症及免疫反应,最终导致颌骨组织的吸收破坏[2]。在炎症导致的骨吸收过程中,血管的增生有利于释放细胞因子和炎症介质,募集炎症细胞及破骨细胞前体,从不同方面参与骨吸收过程[3],提示血管生长与骨破坏密切相关。根尖周囊肿长期处于慢性炎症刺激下,囊壁中毛细血管大量增生,调控其血管的生长可能影响其骨吸收,但血管增生在其骨破坏过程中的作用尚未明确。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一种强有力的促内皮细胞有丝分裂因子,通过影响内皮细胞的增殖、分化和迁移调控血管生长[4]。VEGF能够增加血管通透性,促进血浆蛋白渗出,造成炎症组织水肿[5]。同时,VEGF还具有单核细胞趋化功能,促进破骨细胞前体渗出并聚集于局部组织[6];也有研究表明VEGF与M-CSF作用相似,可直接促进破骨细胞的分化与成熟[7]。已有学者证实VEGF在根尖周囊肿中高表达[8],但其在根尖周囊肿骨吸收过程中的作用有待进一步探讨。

本研究探讨根尖周囊肿骨破坏与血管增生之间的相关性,同时阐释VEGF在囊肿血管化与骨破坏过程中扮演的角色。

1 材料与方法

1.1 主要试剂及仪器

根尖周囊肿标本(同济大学附属口腔医院口腔颌面外科);酶联免疫吸附法(ELISA)检测试剂盒、VEGF抗体(武汉博士德);CD34抗体(Abcam,美国);二抗及DAB显色液(北京中杉金桥);α-MEM培养基(Gibco,美国);胎牛血清(Excel,澳洲);RANKL(R&D,美国),小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7(ATCC®SC-6003)、贝伐单抗(Genentech Inc.,USA);I型胶原酶、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)试剂盒(Sigma,美国);Trizol Reagent、逆转录试剂盒(Life Technologies,美国);SYBR GREEN(Roche,瑞士)。

1.2 病例收集

收集2016 年9 月~2017 年12 月同济大学附属口腔医院口腔颌面外科经根尖手术切除的根尖周囊肿病例32 例,纳入标准为:由复旦大学肿瘤医院病理科根据临床特征、影像学及病理信息诊断为根尖周囊肿;全景片显示根尖周囊肿边界清晰;病历信息完整(包括姓名、性别、年龄、及影像学信息等); 3 个月内未服用抗生素和其他激素类药物;无全身系统性疾病。选取6 例正颌手术患者颌骨骨松质,提取骨髓间充质成纤维细胞作为对照组。本实验已获得患者知情同意,并取得同济大学伦理委员会批准同意。

1.3 HE染色及骨破坏面积测量

根尖周囊肿石蜡标本切片4 μm厚,常规脱蜡、水化后, HE染色观察。使用Image-Pro Plus 6.0测量全景片中根尖周囊肿低密度影像面积作为其骨破坏面积。

1.4 免疫组织化学染色

根尖周囊肿石蜡标本切片4 μm厚,常规脱蜡、水化后,以鼠抗人CD34抗体(1∶500)、鼠抗人VEGF抗体(1∶200)4 ℃过夜孵育,羊抗鼠生物素标记二抗(1∶200) 37 ℃孵育1 h, DAB显色,常规脱水、透明、封片[9]。使用PBS代替一抗作为阴性对照。随机选取5 个400 倍镜下视野,Image-Pro Plus 6.0测量血管腔面积,每个视野下血管面积之和计为微血管密度。VEGF表达量采用累积光密度(IOD)计算染色强度[10]。

1.5 细胞培养

酶消化法与组织块法分离提取14 例根尖周囊肿囊壁成纤维细胞和6 例颌骨骨髓间充质成纤维细胞,原代培养于α-MEM[含1%双抗(青霉素100 U/ml, 链霉素100 U/ml), 2 mmol/L L-谷氨酰胺,10% 胎牛血清]中。于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。

1.6 ELISA及RT-qPCR

酶联免疫吸附反应检测(ELISA):取实验组与对照组P3代细胞的培养上清,用酶联免疫吸附反应双抗夹心法检测上清中VEGF的含量,严格按照试剂盒说明操作。实时荧光定量PCR(RT-qPCR):收集两组P3代细胞,加入Trizol裂解液,提取细胞总RNA,逆转录合成cDNA后进行定量PCR。引物设计如下:VEGF:5′-TTATGCGGATCAAACCTCACC-3′,5′-GAAGCTCAT-CTCTCCTATGTGC-3′; β-actin: 5′-CATGTACGGTTGCTATCCAGGC-3′,5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。

1.7 制备条件培养基和诱导RAW264.7破骨向分化

将实验组与对照组细胞接种于100 mm培养皿,当细胞达到70%~80%汇合时,更换无血清α-MEM培养基培养7 d, 550 g离心10 min,弃沉淀后,取50%上清、40%新鲜α-MEM、10% FBS和20 ng/μl RANKL混合制备条件培养基。实验组条件培养基一式两份,其中一份加入贝伐单抗作为加药组。Raw264.7细胞以每孔1 000 个细胞接种于24 孔板, 3 组条件培养基分别诱导,每2 天换液至第10天。 TRAP染色,计数破骨细胞,仅TRAP阳性且细胞核≥3 个的细胞计为破骨细胞。

1.8 统计分析

2 结 果

2.1 根尖周囊肿HE染色及影像学表现

本实验所有病例均表现出典型的根尖周囊肿特点,HE染色显示囊肿纤维囊壁内衬复层鳞状上皮,上皮钉突发生不规则增生、伸长,相互融合成网状,纤维囊壁内富含胶原纤维,可见较多慢性炎症细胞浸润。影像学表现为围绕根尖的圆形或椭圆形低密度透射影像,周围偶有密度增高的骨白线(图1)。

图1 根尖周囊肿HE染色(A~B)及影像学表现(C) (A: ×40; B: ×200)

2.2 根尖周囊肿骨破坏面积与VEGF的表达及微血管密度成正相关

VEGF在根尖周囊肿的上皮细胞,成纤维细胞、血管内皮细胞、炎症细胞及细胞外基质中呈阳性表达。CD34阳性的内皮细胞包绕形成的微血管广泛分布于囊壁间质中(图2)。卡方检验结果表明根尖周囊肿骨破坏面积与年龄、性别、部位等无关,但与VEGF的表达以及微血管密度成正相关(P<0.05)(表1)。

图2 根尖周囊肿VEGF及血管免疫组织化学染色 (A、C: ×100; B、D: ×400)

表1 骨破坏面积与临床病理特征的联系 [n(%)]

2.3 根尖周囊肿囊壁成纤维细胞较对照组VEGF表达增高

RT-qPCR检测根尖周囊肿囊壁成纤维细胞及颌骨骨髓间充质成纤维细胞中VEGF的含量,结果显示实验组较对照组VEGF的表达显著增多(P<0.05)。ELSA检测上述2 组细胞培养上清中的VEGF蛋白含量,结果显示实验组细胞较对照组分泌更多的VEGF,差异具有统计学意义(P<0.05)(图3)。

图3 VEGF在实验组与对照组中的表达

2.4 根尖周囊肿囊壁成纤维细胞分泌的VEGF能有效促进破骨细胞分化

收集上述2 组细胞培养液上清,制备条件培养基,诱导细胞系RAW264.7破骨向分化,结果表明实验组破骨细胞分化效率显著高于对照组(P<0.05)。在根尖周囊肿组条件培养基中加入贝伐单抗抑制VEGF后,其破骨细胞诱导效率显著下降(P<0.05),如图4所示。

A: 对照组(×400); B: 实验组(×400); C: 加药组 (×400)

3 讨 论

根尖周囊肿一般经历根尖周组织炎症反应、马拉瑟上皮剩余增殖、液化坏死囊性变等一系列病理过程,造成颌骨组织破坏[11]。骨质破坏范围较大时可引起病理性骨折,但其骨破坏机制尚未明确。Zizzi等[12]研究发现囊肿中微血管密度增加、炎症浸润程度增强、炎性蛋白渗出可能造成组织水肿,对颌骨产生压迫性骨吸收。也有研究表明VEGF在慢性根尖周炎过程中表达增多,促进血管增生及血管通透性增加[13],但他们并未直接证实囊肿中血管增生及VEGF的表达与骨破坏之间的相关性,以及VEGF对破骨细胞的直接作用。因此本研究将从这两方面对VEGF在根尖周囊肿骨破坏过程中的作用进行探讨。

本研究通过免疫组织化学染色方法显示VEGF在根尖周囊肿囊壁成纤维细胞、炎症细胞以及细胞外基质中均有表达,微血管广泛分布于囊壁间质中。根尖周囊肿的骨破坏面积与囊壁中微血管密度、VEGF的表达强度成正相关。此结果表明囊肿中高表达的VEGF可通过促进血管的增生从而增加其骨吸收功能。这与前人的研究结果一致[13-14],Graziani等[15]研究证实根尖周囊肿囊壁间质较上皮表达更高的VEGF,且其表达强度与微血管数目相关,后者与炎症浸润程度相关。提示血管化在炎症导致的骨吸收过程中的重要作用。而VEGF则能通过促进血管生长,增加血管通透性,从而使血浆蛋白渗出,囊液聚集,囊内压力增加,进而促进囊肿扩大对颌骨产生压迫性骨吸收[8,12,16]。

骨组织的破坏由破骨细胞所介导,破骨细胞表面表达VEGF受体,VEGF与其受体结合后能够直接激活破骨细胞,促进其成熟、分化并发挥骨吸收活性[17]。为进一步探究VEGF对破骨细胞的作用,本实验分离培养了根尖周囊肿囊壁成纤维细胞,与颌骨骨髓间充质成纤维细胞对比,发现其较对照组高表达VEGF,且其破骨细胞诱导效率更高,而在加入贝伐单抗抑制VEGF后破骨细胞诱导效率显著下降。这说明根尖周囊肿囊壁成纤维细胞所分泌的VEGF能够有效促进破骨细胞分化。也有研究表明在多种骨吸收疾病中,VEGF作为一种募集破骨细胞前体的重要分子[6],能够增加破骨细胞前体从血管中渗出,从而增加局部组织中破骨细胞的来源。VEGF通过影响破骨细胞的来源、分化、成熟及其功能,最终促进骨质吸收破坏[18]。

综上所述,根尖周囊肿囊壁高表达的VEGF一方面可通过促进血管增生,血管通透性增加,炎症因子及血浆蛋白渗出,导致囊液聚集,囊肿扩大而产生压迫性骨吸收;另一方面,VEGF通过募集破骨细胞前体,并直接作用于破骨细胞促进其分化成熟,进一步加剧了根尖周囊肿的骨破坏。VEGF在囊肿骨破坏过程中的重要作用,使得它可能成为临床上对于根尖周囊肿诊断及治疗的一个新靶点,但还需进一步深入研究其中的作用机制。

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