祛痰活血方上调SOCS1抑制TLR4/NF-κB信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎小鼠肝损伤＊

朱晓宁，汪 静，张玉蓉，尹 玥，彭孟云，曾 勇

（西南医科大学附属中医医院 泸州 646000）

非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是目前全球最常见的慢性肝脏疾病，疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪变（Nonalcoholic fatty liver，NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis，NASH）及相关肝硬化、肝癌[1，2]。NASH被认为是NAFL 发展为肝硬化甚至肝癌的最重要一环，其发生主要是由于循环中游离脂肪酸（Free fatty acids，FFAs）异常升高超过肝脏的氧化和代谢能力，脂质在肝细胞沉积产生大量过氧化物，通过激活Myd88依赖途径的Toll 样受体4（Toll-like receptor 4，TLR4）活化Kupffer 细胞，从而启动NF-κB 凋亡通路，诱导肝细胞发生凋亡[3-6]。有研究显示[7]，细胞因子信号抑制蛋白1（Suppressor of cytokine signaling1，SOCS1）过表达可直接抑制TLR4/NF-κB信号通路激活改善肝脏炎症。

祛痰活血方是根据全国名老中医药专家孙同郊教授“和调”思想指导下“调和少阳枢机”治法形成的治疗NASH 经验方。我们的前期研究证实[8,9]，该方能明显改善NASH 患者肝功能，其作用机制与降低NFκB 表达有关。但是，该方如何调控NF-κB 表达治疗NASH 的具体机制仍不清楚。因此，本研究通过动物实验侧重观察祛痰活血方通过调控SOCS1抑制TLR4/NF-κB 信号通路改善非酒精性脂肪性肝炎肝损伤的作用。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 实验动物

SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠30 只，体质量（20-22）g，均购于四川达硕实验动物有限公司（SCXK（川），2015-030），饲养于恒温（20± 2）℃，明暗交替各12 h，无特定病原体环境下。

1.1.2 实验药物与试剂

祛痰活血方浸膏制备：祛痰活血方配方（陈皮10 g，茯苓15 g，法半夏10 g，薏苡仁20 g，泽泻20 g，郁金15 g，丹参15 g，生山楂15 g，柴胡12 g，黄芩10 g，决明子15 g，炙甘草3 g），剂量换算参考人与动物之间的体表面积之比。本实验根据前期的研究结果[10]，选择最佳的疗效剂量。中药药材煎煮、提取、浓缩由西南医科大学附属中医医院制剂室完成。

试剂：ALT、AST、TC、TG 试剂盒购自南京建成生物工程研究所，油红O 染色试剂盒（Solarbio）；总RNA提取试剂盒（天根生物科技（北京）有限公司）；逆转录试剂盒和SYBR Green 实时荧光定量PCR（Real-time PCR）Master Mix（日本Toyobo 公司），引物序列由生工生物（上海）有限公司合成；TLR4、SOCS1、NF-κB 抗体（Abcam公司），Myd88抗体（Santa公司）。

1.1.3 主要仪器和设备

超低温冰箱（Thermo 公司）、全自动酶标仪（芬兰雷勃公司）、荧光显微镜（Nikon）、高速低温离心机（Sigma公司）、实时荧光定量PCR仪（德国Eppendorf）、全能蛋白转印系统及凝胶扫描成像系统（美国Bio-Bad公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、造模及给药

30 只C57BL/6J 小鼠适应性喂养1 周后，随机分为正常组、模型对照组和祛痰活血方组。正常组给予普通饲料，模型对照组和祛痰活血方组给予蛋氨酸胆碱缺乏（MCD）饲料（购于南通特洛菲饲料科技有限公司）。第4周结束时，随机取模型对照组和祛痰活血方组小鼠各2只，观察肝组织病理。确认造模成功后，正常组和模型对照组灌胃生理盐水，祛痰活血方组给予中药灌胃4 周，给药期间模型对照组和祛痰活血方组持续MCD饲料喂养。

表1 Real-Time PCR引物序列

1.2.2 小鼠一般情况及体质量

观察小鼠食欲、大便及外界反应，每周称体质量并登记。

1.2.3 肝脏酶学及血脂指标检测

分离血清，测定ALT、AST、TC、TG含量。

1.2.4 肝组织病理学与免疫组化

新鲜组织固定脱水包埋后切片，HE及油红O染色观察肝脏脂肪变及炎症程度。免疫组织化学法检测SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB的表达。

1.2.5 Real-Time PCR 检测小鼠肝组织SOCS1、TLR4、Myd88和NF-κB的表达

取肝组织提取总RNA，逆转录为cDNA，按试剂盒说明书进行Real-time PCR，以β-actin 为内参，用比较循环阈值（CT）的方法进行靶基因mRNA 表达水平的相对定量。引物由生工生物（上海）有限公司合成（表1）。

1.2.6 Western blot 检 测 小 鼠 肝 脏SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB蛋白的表达

液氮研磨肝组织，冰上裂解30 min，离心收取上清，测定蛋白浓度，蛋白热变性后，电泳分离转膜，经一抗、二抗孵育洗膜后加入适量显影液，曝光显影。

表2 各组小鼠不同时间体质量比较（g，±s）

表2 各组小鼠不同时间体质量比较（g，±s）

注：与本组前一个时间点比较，△P ＜0.05；与正常组同时间点比较，▲P ＜0.05；与模型对照组同时间点比较，*P ＜0.05。

组别正常组模型对照组祛痰活血方组n n 第8周24.79±1.81 13.15±0.58△▲14.01±0.38△▲10 10 10第0周24.32±0.40 23.20±1.08 22.75±0.86 10 8 8第4周26.98±0.47△15.75±0.49△▲16.23±0.37△▲

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件进行实验数据统计处理。计量资料采用±s表示，三组间比较用方差分析和Shapiro-Wilk 检验进行两两比较，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般情况及体质量变化

实验期间3 组小鼠饮食及排便基本正常，正常组小鼠反应迅速，动作灵敏，皮毛整洁有光泽；模型对照组小鼠体质量降低明显，活动较少，皮毛油腻；祛痰活血方组中药灌胃后一般情况有所缓解（表2）。正常组小鼠第4 周较前体质量增加（P ＜0.05），第8 周体质量较前无差异（P ＞0.05）；模型对照组和祛痰活血方组小鼠体质量随时间延长逐渐降低（P ＜0.05）。与正常组比较，模型对照组和祛痰活血方组小鼠体质量第4、8 周均明显降低（P ＜0.05）；与模型对照组比较，祛痰活血方组小鼠体质量在第4、8 周体质量变化无差异（P ＞0.05）。

2.2 各组小鼠肝脏酶学及血脂指标比较

与正常组比较，模型对照组ALT、AST、TC、TG 水平均明显升高（P ＜0.05），祛痰活血方组ALT、AST 水平均明显升高（P ＜0.05），TC、TG组无统计学意义（P ＞0.05）。与模型对照组比较，祛痰活血方组ALT、AST、TC、TG水平较模型对照组明显降低（P ＜0.05）（表3）。

2.3 HE染色及油红O染色观察小鼠肝病理变化

HE 染色：正常组小鼠肝小叶结构清晰、完整，肝细胞排列整齐，未见肝细胞气球样变及炎症细胞浸润；模型对照组小鼠肝小叶结构已破坏，可见大量气球样变，局部可见大量炎细胞浸润；祛痰活血方组小鼠肝小叶炎症及脂肪变程度较模型对照组均明显改善（图1）。

油红O 染色：正常组小鼠肝细胞可见少许点状红色脂滴，模型对照组肝细胞可见大量大小不等的红色脂滴，祛痰活血方组肝细胞内脂滴较模型对照组减少（图2）。

2.4 各组小鼠肝脏SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB 的表达

正常组小鼠肝脏SOCS1 阳性表达，TLR4、Myd88、NF-κB 无阳性表达；模型对照组及祛痰活血方组小鼠肝脏SOCS1、TLR4、Myd88、NF-κB 均阳性表达。与正常组比较，模型对照组小鼠肝脏SOCS1 阳性表达降低，TLR4、Myd88、NF-κB 表达升高；与模型对照组比较，祛痰活血方组TLR4、Myd88、NF-κB 表达降低，SOCS1表达升高（图3-图6）。

表3 各组小鼠肝脏酶学及血脂指标比较（±s）

表3 各组小鼠肝脏酶学及血脂指标比较（±s）

注：ALT，丙氨酸氨基转移酶；AST，门冬氨酸氨基转移酶；TC，总胆固醇；TG甘油三酯；与正常组比较，*P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05。

TG/（mmol·L-1）2.04±0.08 2.65±0.16*2.31±0.03△组别正常组模型对照组祛痰活血方组n 10 8 8 ALT/（U·L-1）44.37±4.52 68.57±1.94*52.50±1.87*△AST/（U·L-1）46.67±5.08 66.60±0.26*52.30±2.96*△TC/（mmol·L-1）7.56±0.24 8.71±0.43*7.61±0.41△

图1 各组小鼠肝脏HE染色（×200）

图2 各组小鼠肝脏油红O染色（×200）

图3 各组小鼠肝脏SOCS1的表达（×200）

图4 各组小鼠肝脏TLR4的表达（×200）

图5 各组小鼠肝脏Myd88的表达（×200）

图6 各组小鼠肝脏NF-κB的表达（×200）

表4 各组小鼠肝脏相关基因mRNA的表达（±s）

表4 各组小鼠肝脏相关基因mRNA的表达（±s）

注：与正常组比较，*P ＜0.05；与模型对照组比较，△P ＜0.05

组别正常组模型对照组祛痰活血方组n 10 8 8 SOCS1 1.23±0.15 2.22±0.34*3.56±0.23*△TLR4 1.00±0.06 2.14±0.17*1.17±0.13△Myd88 0.86±0.24 1.86±0.16*1.33±0.29△NF-κB 0.66±0.14 1.28±0.08*0.81±0.10△

图7 各组小鼠肝脏SOCS1、TLR4、Myd88及NF-κB蛋白表达水平

2.5 各组小鼠肝脏SOCS1、TLR4、Myd88 及NF-κB mRNA的表达

与正常组相比，模型对照组SOCS1、TLR4、Myd88及NF-κB 的表达显著升高（P ＜0.05）；祛痰活血方组SOCS1表达显著升高（P ＜0.05），TLR4、Myd88及NF-κB的表达无统计学意义（P ＞0.05）。与模型对照组相比，祛痰活血方组TLR4、Myd88 和NF-κB 的表达降低（P ＜0.05），而SOCS1的表达水平升高（P ＜0.05）（表4）。

2.6 各组小鼠肝脏SOCS1、TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白的表达

与正常组相比，模型对照组小鼠TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白表达升高，SOCS1 蛋白表达降低，祛痰活血方组SOCS1、TLR4、Myd88 及NF-κB 蛋白表达升高；与模型对照组相比，祛痰活血方组TLR4、Myd88 及NF-κB蛋白表达降低，SOCS1蛋白表达升高（图7）。

3 讨论

NASH 的发病机制复杂，与肝细胞内脂质过度堆积、氧化应激、线粒体损伤及Kupffer 细胞活化等多种因素密切相关，其中Kupffer 细胞活化后激活TLR4/NF-κB 通路是NASH 发生肝损伤的关键因素之一[3,11]。近年来研究认为[12，13]，脂质在肝细胞内异常堆积及异常增加的LPS 共同活化Kupffer 细胞后激活了TLR4/NF-κB 通路，从而释放大量促炎症因子引发肝损伤，最终导致了NASH。本研究通过复制MCD 饮食诱导的NASH 小鼠模型观察祛痰活血方改善NASH 肝损伤作用发现：模型对照组小鼠体质量明显降低，肝脏病理显示大量脂滴、气球样变及炎症细胞浸润，血清ALT、AST、TC、TG 水平明显升高，肝组织TLR4、Myd88及NF-κB 的mRNA 和蛋白表达显著升高，提示小鼠因肝细胞脂质过度堆积发生了严重的肝损伤。当给予中药灌胃治疗后，祛痰活血方组小鼠肝脏炎症及脂肪变程度明显减轻，血清ALT、AST、TC、TG 水平明显降低，肝组织TLR4、Myd88 和NF-κB 的mRNA 和蛋白表达降低，说明祛痰活血方能够通过抑制TLR4/NF-κB通路改善NASH小鼠肝损伤。

SOCS1 属于细胞因子信号抑制蛋白家族，是一类由细胞产生并反馈性阻断细胞因子信号转导过程的负性调节因子。目前研究[14]认为在Kupffer 细胞激活后，大量促炎因子的表达增强会上调SOCS1 表达，进而负反馈TLR4/NF-κB 信号通路，从而保护肝细胞。而对于SOCS1对TLR4/NF-κB信号通路的作用方式目前有两种观点[6]，一种观点认为SOCS1直接干预TLR4/NF-κB 信号分子发挥作用，另一种观点认为SOCS1 通过对不同敏感性的信号分子作用，进而直接或间接的干预TLR4/NF-κB信号转导途径而发挥作用。本次研究发现，模型对照组TLR4、Myd88 和NF-κB 的mRNA和蛋白表达均升高，而SOCS1 的mRNA 表达有所升高，蛋白表达呈降低趋势；经中药灌胃后，祛痰活血方组TLR4、Myd88 及NF-κB mRNA 和蛋白表达均降低，SOCS1 mRNA和蛋白表达均升高。以上结果说明祛痰活血方能够上调SOCS1表达直接抑制TLR4/NF-κB信号通路激活。另外，我们推测模型对照组SOCS1 的mRNA和蛋白表达不一致与肝损伤的加重对基因转录抑制有关。

孙同郊教授认为痰湿郁久成瘀是非酒精性脂肪性肝炎发病的始动因素，痰性粘滞，湿性阴冷，二者郁积最易阻塞水道，损伤阳气。胆为气枢，主相火，三焦通调水道，相火熏蒸，气布水行，运转阳气，沟通表里，是谓少阳枢机。枢机不利，易生痰瘀，痰瘀互结，影响肝的疏泄功能则发病，少阳枢机不利是关键病机，故创立祛痰活血方治疗NASH。该方由陈皮、茯苓、法半夏、薏苡仁、泽泻、郁金、丹参、生山楂、柴胡、黄芩、决明子、炙甘草组成，其中柴胡、黄芩、法半夏意在和解少阳，陈皮、茯苓、生山楂调和脾胃气机，薏苡仁、泽泻通利水道，郁金、丹参活血化瘀，诸药合用共奏和解少阳、鼓动中焦气机、活血除湿之功。相关研究证实[15，16]，柴胡、黄芩、郁金、丹参具有抑制炎症介质的分泌、清除自由基、抗氧化及调节免疫功能，陈皮、茯苓、法半夏、薏苡仁、泽泻能够调节脂质代谢异常。可见，祛痰活血方调和少阳枢机不利之功效与降低肝细胞脂质过度堆积和抑制炎症、调节免疫平衡密切相关，从而发挥改善NASH肝损伤的作用。

综上，祛痰活血方具有明确的改善NASH 肝损伤作用，其作用机制与上调SOCS1 表达抑制TLR4/NFκB 信号通路激活有关。然而，祛痰活血方如何上调SOCS1表达的作用机制有待于进一步研究探索。