复方柴归方对CORT诱导的低分化PC12抑郁细胞模型的保护作用及机制研究＊

张静驿，高 耀，陈建丽，秦雪梅，田俊生＊＊，武嫣斐

（1. 山西医科大学临床医学院 太原 030001；2. 山西医科大学第一医院 太原 030001；3. 山西大学中医药现代研究中心 太原 030006）

抑郁症是一种以显著而持久的心境低落为主要临床特征的一类心境障碍[1]。其具有疾病发病率、疾病复发率、疾病致残率高“三高”的特点[2]。抑郁症不仅影响患者的生活质量，还能给患者及家庭带来严重的经济负担[3]。因此，研发有效且不良反应小的抗抑郁症药物对于抑郁症的治疗有重要的意义。

PC12 细胞是一种具有神经内分泌作用的肾上腺髓质嗜铬瘤细胞，常用于抑郁症等疾病的研究[4]。CORT 是HPA 轴末端的重要激素，其异常增加可以导致抑郁特征[5]。实验结果发现大部分抑郁症患者体内的HPA 轴异常激活，从而引起细胞的损伤或凋亡[6]。课题组前期采用代谢组学方法研究确认了CORT诱导低分化PC12 细胞可以作为最适的抑郁症体外研究模型[7]。本实验小组按照新药技术路线，将复方柴归方（FFCGF）研发成的抗抑郁中药新药“柴归颗粒”已经获得国家药物临床试验批件（2018L03149）[8.9]。

课题组前期采用行为绝望模型、慢性温和不可预知应激模型、利血平拮抗模型、5-HT 诱导甩头模型等抑郁症动物模型反复多次对FFCGF 的抗抑郁药效进行了验证，结果发现对小鼠不动时间，CUMS 模型引起的大鼠体重下降、快感缺乏、活动力降低，利血平拮抗致小鼠眼睑下垂、体温下降、运动不能，5-HT 诱导甩头等主要药效指标均具有明显的改善[9-11]，但FFCGF在细胞水平的神经保护作用机制尚不清楚。

本研究拟采用CORT 诱导低分化PC12 抑郁细胞模型，通过测定乳酸脱氢酶释放率、细胞凋亡、线粒体膜电位以及细胞内钙离子含量等指标，探讨FFCGF 细胞保护和抗凋亡作用，观察其对PC12 细胞神经保护作用机制，为柴归颗粒治疗抑郁症作用机制研究提供科学依据。

1 材料

1.1 细胞

PC12细胞购自中国科学院细胞库。

1.2 药品

FFCGF 中药材均购自山西省华阳药业有限公司，经检测符合《中国药典》2015年版规定。

1.3 试剂

胰蛋白酶：北京索莱宝科技有限公司，MTT、DMSO：美国西格玛奥德里奇有限公司，RPMI 1640 培养液、血清：Hyclone，Logan，USA，乳酸脱氢酶试剂盒：北京索莱宝科技有限公司，CORT：中国成都化夏化学试剂有限公司，线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）、Fluo-3 Am 钙离子荧光探针：碧云天生物技术有限公司。

1.4 仪器

细胞培养箱，低速离心机，TGL-16 高速台式冷冻离心机，SynergyMx 多功能酶标仪，BD FACSCalibur 流式细胞仪。

2 方法

2.1 FFCGF提取物的制备及质量控制

按照处方比例组成，参考已有制备工艺及质量控制方法，获得FFCGF 提取物，并对其进行相应的质量控制（每g 提取物中含芍药苷8.9 mg，柴胡皂苷a 2.5 mg）[8]。

2.2 细胞分组、造模及给药

低分化PC12 细胞生长于含10% 胎牛血清的RPMI 1640 培养液中，培养24 h 后，分为6 组，分别是空白组，模型组（500 μM CORT 损伤），FFCGF 低剂量组（50 mg·L-1），FFCGF 中剂量组（100 mg·L-1），FFCGF高剂量组（200 mg·L-1），FFCGF 极高剂量组（400 mg·L-1），逍遥散（XYS）组（200 mg·L-1）、给药时间为36 h。

2.3 细胞活力的测定

给药36 h 之后，首先移除细胞培养液，加入新的培养液100 μL，等待4 h 之后，去掉培养液，加入DMSO 150 μL，混合均匀，最后采用MTT 法于490 nm下测定吸光度值。

2.4 乳酸脱氢酶的测定

给药36 h 之后，将培养液通过1000 rpm 离心机离心5 min，取离心管中的上清液，按照乳酸脱氢酶试剂盒说明书测定乳酸脱氢酶测定。

2.5 细胞凋亡测定

给药36 h 之后，胰酶消化后收集细胞，刺激结束后，用胰酶消化细胞，收集细胞，用PBS 洗涤2次，1000 rpm 离心机离心5 min，然后丢掉上清液，重新加入PBS，通过敲打和过滤的方法制备成细胞悬浮液体，最后加入Annexin V-FITC/PI 双染色剂，孵育时间为20 min，上机检测。

2.6 线粒体膜电位测定

给药36 h 之后，胰酶消化后收集细胞，用PBS 洗涤2 次，1000 rpm 离心机离心5 min，然后丢掉上清液，重新加入PBS，通过敲打和过滤的方法制备成细胞悬浮液体，加入JC-1 染色工作液，孵育时间为20 min，1000 rpm 离心机离心5 min，收集细胞，加入JC-1 染色缓冲液，上机检测。

2.7 细胞内钙离子的测定

给药36 h 之后，胰酶消化后收集细胞，用DHanks 缓冲液洗涤1 次，沉淀细胞，加入Fluo-3 Am 探针37℃孵育30 min。孵育结束后，加入D-Hanks 缓冲液洗涤，沉淀细胞后，于37℃孵育30 min 后，上机检测。

2.8 统计学分析

实验数据以平均值±S.D.形式表示，使用SPSS17.0对实验数据进行统计分析。通过单因素方差分析统计，P ＜0.05 表示具有显著性差异，P ＜0.01 表示具有极显著性差异。

3 结果

3.1 FFCGF 对CORT 诱导的低分化PC12 细胞活力的影响

FFCGF 对CORT 致低分化PC12 损伤细胞活力的影响如图1 所示。模型组的细胞活力与空白组比较，细胞活力值极显著降低。FFCGF 各给药组（100-400 mg·L-1）与模型组比较，细胞活力值均明显升高。结果显示FFCGF 在100 mg·L-1出现统计学意义，且之后随着浓度的升高其吸光度值增加幅度不大，因此后续研究中乳酸脱氢酶的测定、细胞凋亡测定、线粒体膜电位测定、细胞内钙离子的测定均采用100 mg·L-1作为该药物的中剂量组。研究结果同样也表明FFCGF 给予CORT 诱导的PC12 细胞，未表现出明显的剂量依赖关系。

图1 FFCGF对CORT致低分化PC12损伤细胞活力的影响

图2 FFCGF对CORT致低分化PC12损伤细胞乳酸脱氢酶释放率的影响

图3 不同组Annexin V-FITC/PI双染测凋亡流式散点图

3.2 FFCGF 对CORT 诱导的低分化PC12 细胞乳酸脱氢酶释放率的影响

FFCGF 对CORT 致低分化PC12 损伤细胞乳酸脱氢酶释放率的影响如图2所示。模型组的细胞活力与空白组比较，乳酸脱氢酶释放率极显著增加。FFCGF与模型组比较，乳酸脱氢酶释放率明显降低，并且不同浓度的FFCGF 之间无显著性差异。实验结果表明FFCGF 可通过降低CORT 诱导低分化PC12 细胞乳酸脱氢酶释放率发挥保护作用。

3.3 FFCGF 对CORT 诱导低分化PC12 细胞凋亡率的影响

不同组Annexin V-FITC/PI 双染测凋亡流式散点图如图3所示。散点图左上角、右上角、右下角和左下角分别表示死亡、晚凋、早凋和正常状态的细胞。通过散点图我们可以发现模型组的细胞凋亡率与空白组比较，早凋、晚凋和死细胞增加。FFCGF 与模型组比较，早凋、晚凋和死细胞明显降低。

图4 FFCGF对CORT致低分化PC12损伤细胞凋亡率的影响

通过计算不同象限细胞数多少表示细胞的凋亡率结果如图4所示。通过凋亡率结果可以发现模型组的细胞活力与空白组比较，细胞的凋亡率增加。FFCGF 与模型组比较，细胞的凋亡率明显降低。实验结果表明FFCGF 可通过降低CORT 诱导低分化PC12细胞凋亡率发挥保护作用。

3.4 FFCGF 对CORT 诱导低分化PC12 细胞线粒体膜电位的影响

不同组线粒体膜电位流式散点图如图5所示。通过散点图我们可以发现模型组的细胞线粒体膜电位与空白组比较，线粒体膜电位极显著降低。FFCGF 与模型组比较，线粒体膜电位都有显著的升高。

通过计算线粒体膜电位的细胞比例结果如图6所示。通过凋亡率结果我们可以发现模型组的细胞活力与空白组比较，线粒体膜电位降低的细胞数目。FFCGF 与模型组比较，线粒体膜电位降低的细胞显著减少。实验结果表明FFCGF 可通过降低CORT 诱导低分化PC12细胞凋亡发挥保护作用。

3.5 FFCGF 对CORT 诱导的低分化PC12 细胞钙离子的影响

不同组钙离子细胞流式图如图7所示。通过细胞流式图我们可以发现模型组的钙离子与空白组比较，细胞内游离钙离子浓度较大。FFCGF 与模型组比较，细胞内游离钙离子浓度减少。通过定量计算峰面积如图8所示。通过凋亡率结果我们可以发现模型组的细胞活力与空白组比较，荧光强度增至40%左右。FFCGF 与模型组比较，各给药组荧光强度均显著下降。实验结果表明FFCGF 可通过降低CORT 诱导低分化PC12细胞内游离钙离子浓度发挥保护作用。

图5 不同组JC-1探针染色测线粒体膜电位流式散点图

图6 FFCGF对CORT致低分化PC12损伤线粒体膜电位的影响

4 讨论

不同的细胞指标都可以用于评价细胞损伤和凋亡的程度。本研究采用不同的指标对皮质酮诱导低分化PC12 抑郁细胞模型的损伤程度进行综合评价。FFCGF 对皮质酮诱导的低分化PC12 抑郁细胞模型的保护作用也可以用这些指标综合评价。细胞活力是体外细胞培养和研究中的一个重要结果[12]。细胞活力可用于评价模型复制是否成功，同时可以用于评价药物的效应。这些指标均可为新药研究提供重要技术支撑。乳酸脱氢酶是一种糖酵解酶，以氧化型辅酶Ⅰ（MADI）为氢受体，在细胞内催化L-乳酸与丙酮酸之间可逆反应的一种脱氢酶。当细胞膜的通透性发生变化时，细胞胞间的乳酸脱氢酶活性升高[13]，所以乳酸脱氢酶活性可以用来评价细胞的损伤和凋亡程度。

细胞凋亡是指为了维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡[14]。细胞凋亡早期的特征之一是磷脂酰丝氨酸从细胞膜内转移到细胞膜外，使磷脂酰丝氨酸暴露在细胞膜外表面。而人膜联蛋白V（AnnexinV）对磷脂酰丝氨酸具有特异的亲和作用，将Annexin V 进行荧光素——FITC 标记，作为一敏感的探针可检测暴露在细胞膜表面的磷脂酰丝氨酸，利用流式细胞仪观察细胞凋亡现象，从而可以用于研究FFCGF对细胞的保护作用。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件[15，16]。JC-1是一种理想的用于检测线粒体膜电位的荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。同时，钙离子是机体各项生理活动不可缺少的离子。它对于维持细胞膜两侧的生物电位，维持正常的神经传导功能。钙离子的水平的变化影响很多生命活动的变化，例如神经递质的释放、细胞间的信息传递和神经元的存活，因此可以依据钙离子水平的变化判断细胞的存活状态[17，18]。

图7 不同组Fluo-3 Am染色测钙离子细胞流式图

图8 FFCGF对CORT致低分化PC12损伤细胞内钙离子的影响

本课题研究中采用基于抑郁症中HPA 轴活化的理论建立的细胞模型，即高浓度CORT进行刺激，并采用PC12 细胞作为应激对象。HPA 轴亢进假说是建立抑郁症体外模型最常用的理论之一，CORT 诱导PC12细胞损伤模型已经被广泛地应用于抗抑郁药物的药效及机制研究。神经细胞损伤的重要指标之一是神经细胞凋亡。钙离子内流和线粒体膜电位丢失是评价神经细胞凋亡的具体指标。钙离子信号通路在神经元系统的发育中具有至关重要的作用。在神经元中钙离子可调节神经递质的释放、细胞间的信息传递和神经元的存活，因此测定神经元中钙离子水平的变化是对细胞存活状态观察的一个重要指标。同样，线粒体膜电位丢失是细胞早期凋亡的重要特征。线粒体膜电位的降低导致细胞色素C等释放，活化Caspase蛋白酶家族，引起细胞凋亡级联反应，通过检测线粒体膜电位能够判断细胞是否进入不可逆的过程。本文采用流式细胞仪利用JC-1 探针对线粒体膜电位进行检测，从另一个重要方面对药物的保护作用进行研究。因此，抗抑郁药物对膜电位和钙离子浓度变化的影响，对细胞起到很好的保护作用，抑制细胞凋亡，从而可以评价药物对神经细胞的保护作用。

本研究结果表明皮质酮诱导PC12 细胞损伤后，细胞活力指标下降，而乳酸脱氢酶释放率、细胞凋亡率及钙离子浓度指标升高，与已有文献报道一致[19-21]。给予FFCGF 后对应的指标发生回调，表明FFCGF 对CORT 诱导低分化PC12 细胞损伤具有较好的保护作用。该研究结果为复方柴归方抗抑郁药物的成药性评价提供了充分科学依据。