滋补脾阴中药的网络药理学机制分析＊

赵春燕，战丽彬

（南京中医药大学中医学院·中西医结合学院·中医脾藏象现代研究实验室 南京 210023）

“脾阴”一词最早见于南宋·齐仲甫《女科百问》[1]：“有因冷气痞结于脾阴，湿郁而为黄”。现代研究表示脾是一个涉及消化吸收、水盐代谢、能量转化、血液、免疫及神经内分泌等多系统的综合功能单位[2]，其病理多表现为涉及多器官、多系统的复杂病理改变。脾阴是脾中水谷精微所化生的营血、津液、脂膏等精微物质，与脾阳一起维持脾脏的正常生理功能。脾脏有病多为虚证，脾阴虚是其常见证候之一。近年来，具有滋补脾阴功效的中药被广泛运用于消化系统疾病及痴呆、糖尿病等多种常见病中[3]，虽疗效显著，但其分子机制尚不明确，故本文采用网络药理学这种宏观的研究策略，从系统水平探究和梳理滋补脾阴中药发挥药理作用的机制。

网络药理学是一种基于系统生物学的新兴学科，它通过建立单味中药或复方和其活性成分以及药物靶标、生物学通路等网络的方法从分子层面阐明中药的作用机制，由于其分析方法符合中医药治疗模式“多组分”“多靶点”的特点并且可以充分利用网络资源，成为探索中药复方的复杂机制[4,5]、单味中药或中药配伍禁忌的毒理作用[6,7]、新药研发[8,9]等新的思路。本文应用网络药理学的研究思路预测滋补脾阴方剂中使用频次较高且历代医家对其滋补脾阴功效有明确论述的5 味中药的活性成分、潜在靶点以及靶点参与的通路，结合网络拓扑指数分析和分子对接实验，在分子层面上阐明滋补脾阴中药的共性机制，为探究滋补脾阴中药的作用机理提供数据支撑，从而为更加深入的探究脾阴学说提供思路。

1 材料与方法

1.1 代表性滋补脾阴中药选择及其活性成分遴选

本文按照以下3个原则（临床常用中药，滋补脾阴方剂中使用频次较高，历代著述中对其功效由明确记述）筛选出有代表性的滋补脾阴中药。各味中药活性化合物来源于TCMSP 数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）、TCMID 数据库（http://www.megabionet.org/tcmid/）以及文献。以药物动力学（Absorption and distribution and metabolism and excretion，ADEM）参数中类药性（Drug likeness，DL）≥0.18 作为指标进行筛选，该指标用来评价分子是否含有特定的功能基团或与大部分药物相同或相似的物理特征，被广泛用于药物开发[10]。

1.2 滋补脾阴中药靶点预测

通过TCMSP 数据库和STITCH（http://stitch.embl.de/）数据库获得成分作用靶点。其中，TCMSP 数据库中的化合物靶点信息主要来源于DrugBank 数据库。同时，将查询到的化合物信息输入PubChem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）中进行查询，获得化合物的SMILES 结构式。再将SMILES 结构式输入STITCH 中进行靶点预测，该数据库是化合物与蛋白质之间已知或预测的相互作用的数据库，可利用化学相似性预测化合物靶点。将查询对象限定为人源基因（Homo sapiens）作为研究对象，选择Tanimoto score ≥0.9 的检索结果为相似化合物进行靶点预测。

1.3 滋补脾阴中药功能网络构建及节点重要性评价

为明确滋补脾阴中药靶点间的相互作用关系，将其潜在靶点导入功能蛋白相互作用数据库（String，https://string-db.org），选择较高置信度0.800，将蛋白种类限定为人源（Homo sapiens），导出靶点关联信息，在Cytoscape 3.7.1软件中导入节点信息进行可视化，仅保留最大的连通片，并用ClusterMaker 插件对网络中的节点进行聚类排列。获得蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein interaction，PPI）网络。

本研究采用PageRank[11]算法评价蛋白在网络中的重要性，该算法是复杂网络节点重要性排序的经典算法，作为全局算法的1 种，它的策略可概括为“某1个节点的邻节点越重要，则这个节点越重要”[12]。将蛋白互作信息导入R软件（https://www.r-project.org）3.5.3，利用igraph 安装包构建PPI 网络并计算每个蛋白的PageRank 值，大于二倍平均值的蛋白被认为是滋补脾阴中药作用的关键靶点。为突出滋补脾阴中药药理机制的共性，利用R 软件查找各中药间的重合靶点，绘制韦恩图（VennDiagram 安装包），5味中药共同作用的靶点同样被认为是关键靶点。将滋补脾阴中药关键靶点及其来源化合物信息导入Cytoscape 3.7.1 软件中构建“中药-化合物-关键靶点”网络。

1.4 京都基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将滋补脾阴中药潜在靶点数据导入DAVID 数据库（https://david.ncifcrf.gov/）进行KEGG 通路富集分析，P ＜0.05 表示具有统计学意义。通过KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库获得富集通路的详细信息。并将最为富集的20 条通路信息导入R软件（ggplot2安装包）中绘制气泡图。

1.5 滋补脾阴中药疾病关联度分析

为明确滋补脾阴中药在疾病中的应用价值，通过治疗靶点数据库（TTD，http://db.idrblab.net/ttd/）获取PageRank 值大于平均值的靶点的相关疾病信息，该数据库中的疾病带有ICD-11（国际疾病分类）编码，基于该编码对所有疾病分类，利用R 软件（ggplot2 安装包）绘制柱状图，将各类疾病累计出现的次数可视化。

1.6 分子对接验证关键靶点

分子对接是一种评价药物活性小分子与靶蛋白结合能力的方法，本实验采用AutoDock4.2.6（http://autodock.scripps.edu）软件对5 味滋补脾阴中药的共同靶点进行半柔性对接。蛋白构象来源于Protein Data Bank（http://www.rcsb.org）数据库，通过文献筛选合适的PDB ID。活性化合物MOL2 文件来源于TCMSP 数据库。首先使用AutoDock Tools（ADT）对蛋白进行加氢、去水和加电荷预处理，并将化合物和蛋白输出为PDBQT 格式，之后用AutoGrid 计算能量格点，采用遗传算法对化合物和靶蛋白进行对接，并对其结合能力进行打分。采用Pymol软件对关键化合物和蛋白间的对接结果进行绘图。

2 结果

2.1 滋补脾阴中药选择及活性成分遴选

黄一卓[1]及金景熙[13]等人对古今医案进行统计，归纳出滋补脾阴方剂中使用频次较高的中药（图1），本研究基于上述数据结合历代医家的论述，将山药、白扁豆、白芍、茯苓及芡实5味中药纳入研究范围。通过数据库和文献检索及ADME 参数筛选，经过去重后最终得到拥有靶蛋白的69个活性化合物，其中山药活性成 分22 个，茯 苓18 个，白 芍22 个，扁 豆4 个，芡实8个。

图1 古今滋补脾阴方剂中使用频次较高的中药

2.2 活性成分靶点预测

整合TCMSP 数据库和STITCH 数据库中获得各味中药潜在的靶点，经上述条件筛选并剔除各自的重复项后获得山药潜在靶点83 个，茯苓118 个，白芍149个，白扁豆30 个，芡实80 个，最终共获得靶点276 个，对各药味靶点重复情况进行分析（图2）。中药间各有重复靶点，其中血管内皮生长因子A（VEGFA）、环氧化酶1（PTGS1）和环氧化酶2（PTGS2）为5 味中药共同的作用靶点，从而推测以上3 个靶点在这类中药发挥药理作用的过程中至关重要。

2.3 滋补脾阴中药功能网络构建及节点重要性评价

为直观表示滋补脾阴中药作用靶点间的关系，将靶点信息输入Cytoscape 软件中构建PPI 网络图（图3），利用PageRank 算法给该网络中各节点打分，获得16 个大于二倍平均值的靶点，其中包括RAC-α 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（AKT1）、信号转导子与转录激活子3（STAT3）、转录因子AP-1（JUN）、白细胞介素-6（IL6）、丝裂原活化蛋白激酶8（MAPK8）、胰岛素（INS）、血管内皮生长因子A（VEGFA）、表皮生长因子受体（EGFR）等。加上2.2 中筛选出的共同作用靶点，共获得18个关键靶点（表1）。从图中可看出这些关键节点（红色）分别存在于较大的聚类单位中，处于同一个聚类单位中的蛋白可能具有更强的相互作用并参与同样的生物学功能。

图2 滋补脾阴中药靶点韦恩图

“滋补脾阴中药-化合物-关键靶点”网络（图4）中包含61个节点（5个中药、38个化合物和18个蛋白）和206 条边。其中PTGS2 有32 个来源化合物，PTGS1 有21 个来源化合物，说明这2 个靶点在5 味滋补脾阴中药间存在着确切的共性。熊果酸（ursolic acid）拥有9个关键靶点，是网络中贡献度最大的化合物。分析网络中化合物信息（表2）。

图3 滋补脾阴中药潜在靶点PPI网络

表1 滋补脾阴中药作用的关键靶点

2.4 京都基因组百科全书（KEGG）通路富集分析

将滋补脾阴中药的靶点通过DAVID 及KEGG 数据库进行通路注释及分析，得到98 条显著富集的通路。根据P 值大小，将最为富集的20 条通路用富集点图表示（图5），图中气泡大小代表通路中富集基因的数目，颜色按照P 值大小依次由红色向绿色渐变。结果显示，滋补脾阴中药主要作用的通路有HIF-1 信号通路、癌症通路、胰岛素抵抗、PI3K-Akt 信号通路、结直肠癌、细胞色素P450 在外源化合物代谢中的作用、花生四烯酸代谢、mTOR信号通路等。

表2 关键靶点来源化合物信息

图4 “滋补脾阴中药-化合物-核心靶点”网络

图5 滋补脾阴中药潜在靶点的KEGG通路富集点图

图6 滋补脾阴中药潜在作用的疾病统计

2.5 滋补脾阴中药疾病关联度分析

查找PPI 网络中大于PageRank 平均值的99 个靶点的相关疾病，共获得195 种疾病，按ICD-11 编码可分为20 类，将频数＞5 的类别绘制为柱状图（图6）。其 中 肿 瘤（2A00-2F9Z，29.74%）、神 经 系 统 疾 病（8A00-8E7Z，10.77%）、内分泌、营养和代谢疾病（5A00-5D46，7.18%）、消化系统疾病（DA00-DE2Z，7.18%）、肌肉骨骼系统和结缔组织疾病（FA00-FC0Z，7.18%）占比较高。在统计结果中，滋补脾阴法治疗结直肠癌[18]、乳腺癌[19]等恶性肿瘤，2型糖尿病[20]等内分泌疾病，认知功能障碍[21]、肌营养不良[22]等神经系统疾病及溃疡性结肠炎[23]、肠易激综合征[24]等消化道疾病皆可见临床报道。除此之外，本次实验结果显示具有滋补脾阴作用的中药还可能在食道炎、酒精性肝病、胆石症、胰腺功能障碍等疾病中有拥有应用潜力，值得从中医传统理论和分子生物学等层面展开深入探讨。

2.6 关键靶点PTGS1/2的分子对接结果分析

对5 味中药共同调节的靶点VEGFA（PDB ID：4KZN）、PTGS1（PDB ID：5WBE）和PTGS2（PDB ID：3LN1）进行分子对接验证（表3）。自由结合能＜0 则代表小分子和蛋白间可以自由结合，＜-5表示有较好的结合活性。结果显示，熊果酸与三蛋白结合活性皆较好，齐墩果酸、β-谷甾醇、β-香树脂醇乙酸酯、常春藤皂苷元、(-)-花旗松素、玉兰脂素A、海风藤酮和豆甾醇等化合物与PTGS1/2 结合活性较好，β-胡萝卜素和薯蓣皂苷元与VEGFA 及PTGS2 结合能力较强。图7 为熊果酸与PTGS2 的相互作用分子对接示意图，小分子与氨基酸残基CLU308、GLY121形成氢键。

表3 PTGS1/2与对应化合物的分子对接结果

图7 PTGS2与熊果酸相互作用分子对接示意图

3 讨论

古今方剂中单纯补益脾阴的极少，明确记载有补益脾阴功效的中药更是寥寥无几。历代医家对各药味的滋补脾阴之功有不同看法，但大都认为山药药效卓著，白扁豆、芡实、茯苓、白芍等药也皆有文献支撑。如明代医家周慎斋在《慎斋遗书》称：“凡嘈杂，脾阴不足，山药宜多用”“茯苓、山药固其脾阴”“芍药，阴分药也，通脾经，性味酸寒，能和血，治虚腹痛也”。清代医家陈其瑞在《本草撮要》中也提到：“山药味甘，入足太阴经，功专健脾，得羊肉补脾阴，得熟地固肾精”。明代贾所学《药品化义》：“白茯苓，味独甘淡，甘则能补，淡则能渗，甘淡属土，用补脾阴，土旺生金，兼益肺气”。清·张德裕《本草正义》：“芍药古无赤白之分，而功用自别，白者冷而微酸，能益太阴之脾阴，而收涣散之大气”。清·吴澄在《不居集》中论述：“扁豆、谷芽补脾阴，而不燥肺金”。清·王旭高《王旭高临证医案》：“加扁豆培养脾阴，土旺自能生金也”。明代张介宾在《景岳全书》中论芡实：“味甘，气平，入脾肾两脏。能健脾养阴止汤”。如故最终将以上5 味药纳入研究范围。

本研究发现滋补脾阴中药通过大量靶点和通路协同发挥作用，其中环氧化酶、花生四烯酸代谢、细胞色素P450 酶和5-羟色胺等是其影响的一个大的功能聚类单元。环氧化酶（Cyclooxygenase，COX）又称前列腺素内氧化酶还原酶，是花生四烯酸代谢通路中的关键酶。战丽彬教授[25]指出脾的生理功能之一可概括为肌肉组织、血液系统和免疫功能。而花生四烯酸在血液、肝脏、肌肉等器官和组织中起着重要的生理作用，同时也是合成前列腺素（prostaglandins），血栓烷素（thromboxanes）和白细胞三烯（leukotrienes）等二十碳衍生物的直接前体，对人体造血和免疫调节具有十分重要的意义[26]。在神经系统方面，花生四烯酸被证明直接参与了可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（SNARE）介导的突触传递[27]，该过程影响神经递质的释放，其异常往往会导致神经系统功能的紊乱。细胞色素P450 酶（Cytochrome P450，CYP）也在花生四烯酸肝脏和肾脏中的代谢发挥作用，CYP 是一类广谱生物催化剂，并可以参与脂肪酸、外源物质、治疗药物和信号分子的代谢，包括二十烷类化合物、白三烯和前列腺素类化合物[28]。滋补脾阴中药具有6 个CYP 家 族 的 靶 点，分 别 是CYP1A1、CYP3A4、CYP2C19、CYP1A2、CYP1B1 和CYP4F2。滋补脾阴中药还能通过CYP 或作用于5-羟色胺转运体（SLC6A 4）、5-羟色胺受体（HTR3A）等参与5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）的代谢过程，这种单胺类神经递质大量存在于大脑皮层质及神经突触中，在学习记忆、情绪和内分泌等生理功能以及异常情绪和认知等病理状态中发挥重要作用。《素问·宣明五气》曰：“心藏神，肺藏魄，肝藏魂，脾藏意，肾藏志。”因此，脾阴不足可导致脾不藏意，气血生化无源则脑髓失养，影响正常的认知能力，严重可发展为认知功能障碍，战丽彬教授课题组用滋补脾阴方药治疗糖尿病认知功能障碍动物模型，通过对其展开行为学实验，证实了补益脾阴的方法对糖尿病认知功能障碍有确切的治疗效果[29,30]。

除调节免疫、造血功能和精神情绪外，滋补脾阴中药还调节胰岛素抵抗过程。《灵枢·本脏》曰：“脾脆则善病消瘅易伤。”脾胃积热日久，脾阴亏虚，津液受损，发为消渴。吉训超[31]等人认为胰岛素的功能有赖于脾阳的推动，而胰岛素代谢则与脾阴有关。在本研究中，认为滋补脾阴中药对胰岛素抵抗的治疗作用与mTOR 信号通路和PI3K-Akt 信号通路有密切关联，mTOR 通过激活下游效应蛋白S6K1 从而显著上调胰岛素受体底物IRS 的Ser307（302）和Ser636/639 位点磷酸化水平，导致IRS 的降解，引发胰岛素抵抗[32,33]。而PI3K/Akt 信号通路是胰岛素信息传导的主要通路，可以通过影响多个分子调整葡萄糖代谢和脂质代谢从而调节胰岛素水平[34]。以上可能是滋补脾阴中药治疗2 型糖尿病、肥胖及非酒精性脂肪肝等代谢相关性疾病的分子基础。

滋补脾阴中药还在胃肠道肿瘤及消化系统疾病中发挥重要作用。其分子机制可能与HIF-1 信号通路密切相关，低氧诱导因子-1（HIF-1）是调节氧稳态的核心诱导因子，在肿瘤形成中其亚型HIF-1α（HIF1A）通过调节血管内皮生长因子（VEGF）来促进血管内皮细胞的分裂增殖，有利于胃肠道肿瘤血管的生成和浸润[35]。同时，HIF-1 促进血管生成的作用还有助于重建因疾病损伤的胃肠道黏膜血管[36]。HIF1A能够诱导多种肠壁保护基因的转录，在肠壁中形成保护性黏液层[37]。HIF1A 还与PTGS2等靶点共同参与组织炎症过程，抑制胃肠道炎症，实验证明，HIF1A 和PTGS2 在炎性肠病的肠腔和腺体的上皮细胞等组织中的表达皆显著增加[38]。溃疡性结肠炎肠黏膜中PTGS2 呈高表达，并且在炎症细胞聚集的部位呈强阳性[39]。此外，5-HT在胃肠道中与特异性受体结合后有促进胃液产生、调节胃蛋白分泌、促进胃排空及小肠蠕动等作用[40]。

综上，本文应用网络药理学的研究方法，选取山药、茯苓、白芍、扁豆、芡实5味中药作为滋补脾阴中药的代表进行研究，经过网络拓扑分析和生物信息学分析发现滋补脾阴中药发挥作用主要是通过多个靶点和通路，参与人体物质代谢、免疫、造血、炎症反应等过程，并可以影响神经系统，增强学习与记忆能力。对胰岛素抵抗、胃肠道癌变、神经系统及消化系统病变等机体异常状态和疾病有着多重协同效应。这些发现与人们对脾及脾阴功能的现代认识一致。本次研究为探究滋补脾阴中药的作用机理提供数据支撑，从而为更加深入的探究脾阴学说提供思路。