16种农药制剂对意大利蜜蜂的急性毒性及初级风险评估

张艳峰，王会利

中国科学院生态环境研究中心环境生物技术重点实验室，北京 100085

农药在控制有害生物危害和保障农业生产等方面发挥了重要作用，但是农药的不合理使用也给生态环境和人类健康带来了很多负面的影响[1-2]。研究表明约80%的化学农药施用后会直接进入环境，并在大气、土壤和水等环境介质之间迁移和扩散，而且有可能生物累积和生物放大，进而对环境生物造成严重危害[3]。

蜜蜂是自然界最主要的传粉昆虫，同时为人类提供了丰富的蜂产品[4-5]。蜜蜂在田间采花授粉过程中可通过直接经口摄入和体表接触等途径暴露于农药中，因此，农药在蜜源作物上使用难免会对蜜蜂造成影响，包括行为变化及个体死亡，甚至可导致整个种群的变化。进入21世纪以来，美洲和欧洲相继爆发了大规模的蜂群崩溃失调症(Colony Collapse Disorder)，这些都与现代农业中农药的大量使用密切相关[6-7]。如已被欧盟限制使用的新烟碱类杀虫剂能够在极低的剂量下作用于昆虫神经系统中的烟碱乙酰胆碱受体(nAChRs)，在杀死害虫的同时，也会危害蜜蜂等非靶标生物[8-9]。与其他昆虫相比，蜜蜂基因组中缺乏能够编码解毒酶的基因，这使得蜜蜂更容易受到农药的危害[10]。国内外均将蜜蜂作为监测农药环境风险的指示昆虫[11]，保护蜜蜂种群对于保证环境安全和农业可持续发展关系重大。

农药环境风险评估是在急性毒性试验的基础上，关注农药对整个生态系统直接或间接的影响，是将孤立的环境行为、环境生态和非靶标生物的毒性资料等进行整合，科学评判农药的环境风险，从而更科学、直观地反映农药在使用中对环境影响的实际情况，因此，农药风险评估具有重要的现实意义。本文选择了16种农药制剂，研究其对意大利蜜蜂的急性经口毒性和急性接触毒性，并进行初级风险评估，旨在为我国农药的安全合理使用提供科学依据，同时为这些农药品种的再评估工作奠定基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 试验材料

1.1.1 供试生物

意大利蜜蜂(ApismelliferaL.)，以下简称蜜蜂引种自北京长文山水间养殖中心，实验室自行保种繁育。试验选用大小一致健康活泼的成年工蜂并在试验前饥饿2 h。

1.1.2 药剂

30%虫螨腈悬浮剂、50%丁醚脲可湿性粉剂、10%高效氯氰菊酯水乳剂、10%高效氯氟氰菊酯悬浮剂、30%噻虫胺悬浮剂、21%噻虫嗪悬浮剂、15%高效氯氟氰菊酯·噻虫嗪悬浮剂(3∶2)、10%高效氯氟氰菊酯·噻虫胺悬浮剂(1∶3)、30%草甘膦水剂、30%草铵膦水剂、45%莎稗磷乳油、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1灭草松可溶液剂、50%吡唑醚菌酯水分散粒剂、20%氰霜唑悬浮剂、50%氟啶胺悬浮剂和98.3%乐果原药，均由中国科学院生态环境研究中心农药与环境评价实验室提供；丙酮(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)。

1.1.3 试验设备

试验蜂笼(长×宽×高为9.3 cm×9.3 cm×7 cm的木质方框，上下表面用纱网密封，自制)；饲喂器(底部穿孔的200 μL离心管，美国Axygen公司)；微量点滴仪(Hamilton-DIS50μL，瑞士Hamilton公司)；电子天平(AL104-IC，瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司)；CO2麻醉装置(自制)。

1.2 试验方法1.2.1 蜜蜂急性经口毒性试验

将供试农药制剂用去离子水配制成母液后用50%(m/m)蔗糖水稀释成一系列浓度，详细浓度梯度如表1所示。采用饲喂法对蜜蜂进行染毒，具体操作如下：将蜜蜂麻醉后引入试验蜂笼，用饲喂器取100 μL不同浓度供试物药液饲喂蜜蜂；4 h后取出饲喂器，换用不含供试物的50%(m/m)蔗糖水持续饲喂至试验结束，测定每组药液的消耗量。同时设空白对照组，仅饲喂不含供试物的50%(m/m)蔗糖水。处理组和对照组均设3个重复，每个重复10头蜜蜂。处理后24 h和48 h分别观察蜜蜂的中毒症状与死亡情况。暴露实验在(25±2) ℃、相对湿度为50%～70%的黑暗人工气候室内进行。

1.2.2 蜜蜂急性接触毒性试验

将供试农药制剂用丙酮配制成母液后用丙酮稀释成一系列浓度，详细浓度梯度如表1所示。采用微量点滴法对蜜蜂进行染毒，具体操作如下：将蜜蜂麻醉后取出，用微量点滴仪吸取供试物药液，于蜜蜂中胸背板处点滴1 μL，待蜂身晾干后，将染毒蜜蜂转移至试验蜂笼，用50%蔗糖水(m/m)持续饲喂至试验结束。同时设空白对照组和溶剂对照组，空白对照组只引入麻醉的蜜蜂不点滴，溶剂对照组只用丙酮进行点滴，其他同处理组。处理组、空白对照组和溶剂对照组均设3个重复，每个重复10头蜜蜂。处理后24 h和48 h分别观察蜜蜂的中毒症状与死亡情况。暴露实验在(25±2) ℃、相对湿度为50%～70%的黑暗人工气候室内进行。

表1 16种农药制剂田间推荐最高施用量及染毒浓度Table 1 The maximum recommended application rates (AR) and exposure levels of 16 pesticide formulations

1.2.3 乐果参比试验

参比试验方法同1.2.1和1.2.2。

1.3 数据处理

根据蜜蜂实际暴露量和死亡率，采用SPSS18.0软件Probit概率统计法计算48 h半致死剂量(48 h-LD50)及95%置信区间。风险商值(RQ)按照喷施暴露场景下的公式RQ=AR/(LD50×50)进行计算，其中，RQ为喷雾暴露场景的风险商值，AR为农药推荐单次最高施用量(g a.i.·hm-2)(表1)，LD50为半致死剂量(μg a.i.·蜂-1)。

1.4 毒性等级和风险等级划分

蜜蜂急性经口毒性和急性接触毒性的等级划分，参照农业部发布的《化学农药环境安全评价试验准则 第10部分：蜜蜂急性毒性试验》[12]分为4个等级：低毒(LD50>11.0 μg a.i.·蜂-1)；中毒(2.0 μg a.i.·蜂-1

对蜜蜂的初级风险评估采用《农药登记 环境风险评估指南 第4部分：蜜蜂》[13]中的RQ值进行表征，RQ≤1时，风险可接受；RQ>1时，风险不可接受。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 急性经口毒性和初级风险评估

8种杀虫剂对蜜蜂的急性经口毒性均为高毒(表2)。45%莎稗磷乳油的48 h-LD50为5.90 μg a.i.·蜂-1，急性经口毒性为中毒。30%草甘膦水剂、30%草铵膦水剂、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1灭草松可溶液剂、50%吡唑醚菌酯水分散粒剂、20%氰霜唑悬浮剂和50%氟啶胺悬浮剂的48 h-LD50均≥100 μg a.i.·蜂-1(表2)，这7种制剂急性经口毒性均为低毒。蜜蜂中毒后表现为行动迟缓，失去平衡等症状，死亡后蜂喙伸出，翅膀展开。30%虫螨腈悬浮剂、50%丁醚脲可湿性粉剂、30%噻虫胺悬浮剂、21%噻虫嗪悬浮剂、15%高效氯氟氰菊酯·噻虫嗪悬浮剂、10%高效氯氟氰菊酯·噻虫胺悬浮剂和45%莎稗磷乳油的RQ值均>1，风险不可接受；其余8种制剂的RQ值均<1，风险可接受(表2)。

表2 16种制剂对蜜蜂的急性经口毒性和风险商值(RQ)Table 2 Acute oral toxicity and risk quotient (RQ) of 16 formulations to Apis mellifera

2.2 急性接触毒性和初级风险评估

8种杀虫剂中，10%高效氯氟氰菊酯·噻虫胺悬浮剂的48 h-LD50为0.000234 μg a.i.·蜂-1，对蜜蜂的急性接触毒性为剧毒；50%丁醚脲可湿性粉剂的48 h-LD50为2.11 μg a.i.·蜂-1，急性接触毒性为中毒；其余6种制剂的急性接触毒性均为高毒(表3)。45%莎稗磷乳油的48 h-LD50为5.42 μg a.i.·蜂-1，急性接触毒性为中毒。30%草甘膦水剂、30%草铵膦水剂、30%氰氟草酯乳油、480 g·L-1灭草松可溶液剂、50%吡唑醚菌酯水分散粒剂、20%氰霜唑悬浮剂和50%氟啶胺悬浮剂的48 h-LD50均≥100 μg a.i.·蜂-1(表3)，这7种制剂的急性接触毒性均为低毒。蜜蜂中毒后表现为行动迟缓，失去平衡等症状，死亡后蜂喙伸出，翅膀展开。30%虫螨腈悬浮剂、50%丁醚脲可湿性粉剂、10%高效氯氰菊酯水乳剂、10%高效氯氟氰菊酯悬浮剂、30%噻虫胺悬浮剂、21%噻虫嗪悬浮剂、15%高效氯氟氰菊酯·噻虫嗪悬浮剂、10%高效氯氟氰菊酯·噻虫胺悬浮剂和45%莎稗磷乳油的RQ值均>1，风险不可接受；其余7种制剂的RQ值均<1，风险可接受(表3)。

表3 16种制剂对蜜蜂的急性接触毒性和风险商值Table 3 Acute contact toxicity and risk quotient of 16 formulations to Apis mellifera

2.3 乐果参比试验

乐果作为参比物质，对蜜蜂急性经口试验48 h-LD50为0.262 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.35 μg a.i.·蜂-1范围内；对蜜蜂急性接触试验48 h-LD50为0.216 μg a.i.·蜂-1，在0.10～0.30 μg a.i.·蜂-1范围内；均符合试验要求[12]，说明试验体系和试验方法可靠。

3 讨论(Discussion)

本研究选取的农药品种涵盖了杀虫剂、除草剂和杀菌剂三大类，它们对蜜蜂的急性毒性和风险差异很大，10%高效氯氟氰菊酯·噻虫胺悬浮剂急性接触毒性和风险最高，48 h-LD50和RQ值分别为0.000234 μg a.i.·蜂-1和1 538.46，与目前关注的新烟碱类和菊酯类杀虫剂对蜜蜂的影响结果一致[14-19]；低毒制剂的48 h-LD50≥100 μg a.i.·蜂-1，最小的RQ值为0.02。总体来看，杀虫剂对蜜蜂的急性毒性较高且风险高，除草剂和杀菌剂对蜜蜂的急性毒性较低且风险低，这可能与致毒机理和作用方式不同有关[20-22]。上述绝大部分制剂对蜜蜂的风险表现为低毒低风险和高毒高风险的趋势，说明急性毒性是风险性的内在决定因素。另一方面，在急性毒性数据基础上，引入田间施用量的因素，更能准确直观地体现农药对蜜蜂的风险，由此可见，严格控制田间施用量，合理使用农药是降低农药风险的重要手段。

10%高效氯氟氰菊酯悬浮剂对蜜蜂的急性毒性为高毒(48 h-LD50分别为0.445 μg a.i.·蜂-1和0.530 μg a.i.·蜂-1)，21%噻虫嗪悬浮剂对蜜蜂的急性毒性为高毒(48 h-LD50分别为0.314 μg a.i.·蜂-1和0.110 μg a.i.·蜂-1)，30%噻虫胺悬浮剂对蜜蜂的急性毒性为高毒(48 h-LD50分别为0.00589 μg a.i.·蜂-1和0.0106 μg a.i.·蜂-1)；高效氯氟氰菊酯和噻虫嗪2种有效成分复配后，15%高效氯氟氰菊酯·噻虫嗪悬浮剂的急性毒性和风险性明显升高(48 h-LD50分别为0.00882 μg a.i.·蜂-1和0.0299 μg a.i.·蜂-1)；高效氯氟氰菊酯和噻虫胺2种有效成分复配后，10%高效氯氟氰菊酯·噻虫胺悬浮剂的接触急性毒性等级升高为剧毒(48 h-LD50为0.000234 μg a.i.·蜂-1)。这可能与2种有效成分不同的致毒机制叠加有关，不同的复配比例、助剂或剂型也可能影响到急性毒性结果。由此可见，复配制剂对环境生物的毒性风险存在差异[23-24]，其不同组分释放到环境中可能会对环境生物产生加和作用、协同作用和拮抗作用等不同的联合毒性效应，导致风险评估的不确定性大大增加[25]。

对蜜蜂的环境风险评估可以明确对蜜蜂存在风险的农药品种，据此实施相应的风险规避措施降低对蜜蜂的危害。美国环境保护局(US EPA)于2014年颁布了农药对蜜蜂的风险评价指南，在农药标签规范中强调禁止在蜜蜂活动区域使用新烟碱类农药，以保护蜜蜂及其他授粉昆虫。欧洲食品安全局(EFSA)于2013年发布了新烟碱类杀虫剂对蜜蜂的风险评估报告，认为该类产品不仅对蜜蜂可产生急性毒害，而且可能对蜜蜂种群带来严重影响，同时限制噻虫嗪、吡虫啉和噻虫胺3种新烟碱类杀虫剂在夏季粮谷类作物和蜜源作物上使用[26]。针对本文中高风险杀虫剂，建议采取如下措施减少对蜜蜂的暴露量：错开作物花期施用甚至考虑晚间施用或施用前及时清除周围蜜源/粉源植物；根据实际需求减少田间施用剂量或减少施药次数；改用低毒化的农药剂型或风险较低的替代农药；保护或临时封闭蜂箱；仅限温室等封闭场所使用。

农药在真实条件下的环境归趋和影响各不相同，施药时间与作物花期之间的关系错综复杂，花粉花蜜中的实际残留量很难获得，因而使得评估结果相对保守，对环境生物的风险可能被高估。梁秀美等[27]研究了茶园花期用药后蜂花粉中吡虫啉及其代谢物的残留量，并评估了对蜜蜂的初级风险，结果表明，吡虫啉在茶树上的使用对蜜蜂具有不可接受的急性接触风险。对蜜蜂高风险的农药品种还需要通过半田间或田间试验，观察农药对蜜蜂的慢性毒性效应、累积毒性效应以及种群生存和生长发育的毒性效应，进行高级风险评估。有些农药母体可能是低毒低风险，但其在环境中的降解产物可能与母体性质迥异，这些降解产物在未来的风险评估中也需要加以关注。本研究一方面为农药的合理使用和管理提供了参考，另一方面提示我们只有通过深入全面的风险评估程序，合理规范的农药使用，才能减少农药对蜜蜂的危害。