miR-17-5p调控PTEN对大鼠中动脉阻塞的神经保护作用研究

(菏泽市立医院神经内科，山东 菏泽 274000)

脑卒中是一种由缺血或出血引起的急性脑功能紊乱性脑血管疾病，其中缺血性脑卒中是导致残疾的首要因素，严重影响患者的生活质量[1-2]。目前，对于脑卒中的处理方法主要有神经保护和再灌注，但仅有再灌注以重组组织纤溶酶原激活剂和机械性破坏血栓在临床试验中取得了成功[3-4]。因此，探索新的或更有效的治疗策略是非常必要的。microRNAs(miRNAs)是一类长度约22 nt的单链核苷酸，结合到目标mRNAs的3′非翻译区(3′UTR)，致使翻译抑制或mRNAs降解，从而参与转录后的基因调控[5]。越来越多的证据表明，miRNAs在神经发育和多种神经疾病中有着重要作用。Rink等[6]的研究认为，miRNAs在缺血性脑卒中的病因学和病理学方面已成为转录后基因沉默的关键介质。miR-210表达抑制对中动脉阻塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)诱发的局灶性缺血性脑损伤有明显的改善作用[7]。而miR-17-5p靶向目的基因对多种疾病均有调节作用，其中也包括了对脑缺血缺氧性损伤的调节作用,然而miR-17-5p在其中的具体作用机制尚未见报道[8-10]。有研究发现，miR-17-5p在一些疾病中可通过靶向第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)发挥调控作用，推测miR-17-5p对脑缺血缺氧性损伤的调节可能与这一机制有关[11]。因此，本文采用线栓法建立MCAO大鼠模型，探讨miR-17-5p对缺血性脑损伤的保护作用及其可能机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及主要试剂

清洁级雄性SD大鼠60只，体质量(205.6±15.2)g，购自中国科学院实验动物中心；miR-17-5p模拟物(miR-17-5p mimic,mimic)、miR-17-5p抑制剂(miR-17-5p inhibitor,inhibitor)购自广州锐博公司；BPV(phen抑制剂)购自上海默克公司；Trizol试剂盒、反转录试剂盒和荧光定量试剂盒购自美国ThermoFisher公司；蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白测定试剂盒购自南京凯基生物有限公司；化学发光液、PVDF膜购自密理博中国有限公司；PTEN，蛋白激酶B(protein kinase B,Akt)，哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of rapamycin,mTOR)一抗、二抗购自Abcam公司；HE染色试剂盒购自碧云天生物技术有限公司；TUNEL试剂盒购自美国EMD Millipore公司。

1.2 方法

1.2.1 分组、造模与给药 将大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(MCAO组)、MCAO+mimic组、MCAO+inhibitor组和MCAO+BPV组，每组12只。适应性饲养1周后开始试验。采用颈外动脉插入线栓法建立MCAO模型[12-14]：大鼠麻醉后，仰卧固定，自颈部正中分离左颈总动脉，结扎近心端，夹闭远心端，剪1个小口插入线栓并固定，松开动脉夹，结扎后缝合肌肉和皮肤。Sham组只作颈部切开，分离后缝合，不作血管结扎处理。造模完成后MCAO+mimic组、MCAO+inhibitor组立即分别进行尾静脉注射50 nmol/kg miR-17-5p mimic、50 nmol/kg miR-17-5p inhibitor，每日1次，持续3 d。MCAO+BPV组建模前1 h尾静脉注射100 μg/kg PTEN抑制剂BPV溶液，并在建模后每6 h腹腔注射1次200 μg/kg BPV溶液，持续24 h。Sham组和MCAO组大鼠给予等量的灭菌生理盐水,在末次给药后24 h进行观察。

1.2.2 大鼠神经功能评分 造模24 h后，参考Bederson法[15-16]对各组大鼠进行神经功能评分：抓住大鼠尾部轻轻提起至超过平面10 cm，观察各组大鼠行为并计分。评分标准：0分，未见活动异常，大鼠被提尾悬空时前肢呈伸展状态，无神经功能损伤；1分，大鼠被提尾悬空时，缺血半球对侧腕、肘屈曲，肩内收屈曲；2分，置大鼠于软塑料板上，轻握鼠尾，在鼠肩后施加侧向推力使鼠滑动约10 cm，缺血半球对侧的侧向推动阻力能力下降；3分，大鼠被提尾悬空时，缺血半球对侧转圈。其中0分为正常，1分为中度，2分及以上为重度。

1.2.3 脑组织含水量测定 对大鼠进行神经功能评分后，断头处死大鼠，快速取出脑组织，用滤纸吸除表面多余水分后称重，记为湿重；将脑组织放入110 ℃烘箱中24 h后称重，记为干重。脑组织含水量=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.2.4 HE、TUNEL染色观察脑组织病理损伤和细胞凋亡情况 取各组大鼠脑组织，4%多聚甲醛固定，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片，厚度为4 μm。用HE染色和TUNEL染色试剂盒对脑组织切片进行染色，于光学显微镜下观察大鼠脑组织病理学损伤和神经元细胞凋亡水平，神经元细胞凋亡率为计数视野中凋亡细胞数目在总细胞数目中的百分比。

1.2.5 RT-PCR检测miR-17-5p和PTEN的mRNA表达水平 取适量脑组织，用Trizol试剂提取各组大鼠脑组织总RNA，用反转录试剂盒合成cDNA，进行PCR扩增后，根据荧光定量PCR试剂盒对cDNA进行检测。miR-17-5p引物：正向，CCA GGA TCC TTT ATA GTT GTT AGA GTT TG；反向，CGG AAT TCT AAT CTA CTT CAC TAT CTG CAC。PTEN引物：正向，TAG AGC GTG CAG ATA ATG AC；反向，GGC TCC TCT ACT GTT TTT GT。β-actin引物：正向，CAT CCT CAC CCT GAA GTA CCC；反向，AGC CTG GAT AGC AAC GTA CAT G。实验所用引物由上海生工设计合成，结果采用2法进行计算。

1.2.6 Western blot检测通路蛋白表达磷酸化水平

在冰上操作，取适量脑组织，加入含蛋白抑制剂的裂解液，充分提取总蛋白。于4 ℃、12 000 r/min离心15 min后收集上清液进行蛋白定量。加入缓冲液，煮沸使蛋白变性。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白并转膜。用5%的牛血清蛋白室温封闭1 h。洗膜后加入一抗(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜。次日加入辣根过氧化物酶标记的对应二抗(1∶3 000)，室温孵育1 h。洗膜后滴加发光液显影，以β-actin为内参。通过凝胶成像仪采集各组蛋白的灰度，分析蛋白相对表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 miR-17-5p对MCAO大鼠脑组织含水量和神经功能的影响

大鼠脑组织含水量和神经功能检测显示，MCAO组大鼠脑组织含水量高于Sham组(图1a)；2组神经功能学评分均在2分以上(图1b)，差异具有统计学意义(P<0.05)，说明MCAO组大鼠模型建立成功。MCAO+mimic组和MCAO+BPV组大鼠脑组织含水量、神经功能评分低于MCAO组(图1)，差异具有统计学意义(P<0.05)；而MCAO+inhibitor组大鼠脑组织含水量、神经功能评分则高于MCAO组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。

a:大鼠脑组织含水量；b:大鼠神经功能评分 *:与Sham组比较,P<0.05；#:与MCAO组比较，P<0.05

图1 大鼠脑含水量和神经功能评分

2.2 miR-17-5p对MCAO大鼠脑组织病理学改变的影响

HE染色观察大鼠脑组织病理损伤发现，Sham组镜下可见细胞排列规则、轮廓清晰，未见核浓染、空泡等病理改变；MCAO组则可见细胞排列紊乱、空泡化增加，细胞核深染，并发生核固缩，胞体溶解，细胞周围的间隙扩大，并呈弥漫性炎性浸润；MCAO+inhibitor组细胞核皱缩浓染、空泡化，胞体溶解、间隙扩大等病理改变更明显；MCAO+mimic组和MCAO+BPV组脑组织病理学损伤明显改善，见图2。

2.3 miR-17-5p对MCAO大鼠脑组织神经元细胞凋亡的影响

TUNEL染色检测大鼠脑组织神经元细胞凋亡率显示，脑组织切片镜下可见MCAO组TUNEL阳性细胞数量多于Sham组，差异具有统计学意义(P<0.05)；MCAO+mimic组和MCAO+BPV组棕色颗粒少于MCAO组，神经细胞凋亡率低于MCAO组，差异具有统计学意义(P<0.05)；MCAO+inhibitor组神经细胞凋亡率高于MCAO组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图3。

图2 大鼠脑组织病理损伤情况

2.4 miR-17-5p和PTEN的靶向关系

采用TargetScan预测软件预测miR-17-5p和PTEN的靶向关系发现，两者在PTEN的3′UTR端存在连续的结合位点，说明miR-17-5p和PTEN存在靶向关系(图4a)。RT-PCR检测两者的mRNA表达水平发现，与Sham组相比，MCAO组大鼠脑组织低表达miR-17-5p，高表达PTEN，差异有统计学意义(P<0.05)；MCAO+mimic组和MCAO+BPV组miR-17-5p表达高于MCAO组，PTEN的mRNA表达量低于MCAO组，差异有统计学意义(P<0.05)；MCAO+inhibitor组miR-17-5p表达低于MCAO组，PTEN的mRNA表达量高于MCAO组，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4b、c。

2.5 miR-17-5p靶向PTEN对MCAO大鼠脑组织中ATK/mTOR通路蛋白磷酸化的影响

Western blot检测各组大鼠脑组织中通路蛋白磷酸化水平显示，MCAO组大鼠脑组织中PTEN的表达水平高于Sham组，AKT和mTOR的磷酸化水平低于Sham组，差异有统计学意义(P<0.05)。同时，MCAO+mimic组和MCAO+BPV组PTEN的表达水平低于MCAO组，AKT和mTOR的磷酸化水平高于MCAO组；MCAO+inhibitor组大鼠脑组织中PTEN表达水平高于MCAO组，AKT和mTOR磷酸化水平低于MCAO组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图5。

*：与Sham组比较，P<0.05；#：与MCAO组比较，P<0.05

a:miR-17-5p和PTEN靶向关系；b:脑组织中miR-17-5p mRNA相对表达量;c:脑组织中PTEN mRNA相对表达量 *:与Sham组比较,P<0.05;#:与MCAO组比较,P<0.05

图4 miR-17-5p和PTEN靶向关系

*：与Sham组比较，P<0.05；#：与MCAO组比较，P<0.05

3 讨论

miRNAs在包括脑卒中在内的许多中枢神经系统疾病的发病过程中都起着重要作用[17-19]。miR-17是miR-17-92簇的成员之一，位于人类的13号染色体和小鼠14号染色体上，是第一组与发育综合征相关的miRNAs群，对多种组织的发育意义重大[20]。在缺血缺氧性脑损伤疾病中，miR-17-5p具有缓解病症的作用。Chen等[10]的研究发现，在缺血缺氧性脑损伤模型中，miR-17-5p表达降低，上调miR-17-5p的表达抑制了NLRP3炎症小体对脑组织的炎症损伤和梗死发生。PTEN定位于染色体10q23.3,是由403个氨基酸组成的磷酸酯酶，是PI3K/Akt/mTOR中重要的负调控因子，PTEN可通过PIP3去磷酸化，拮抗Akt的功能[21]。Miao等[22]发现，在MCAO模型和氧葡萄糖剥夺/复氧(OGD/R)模型中，PTEN高表达促进了神经元细胞死亡。miR-17-5p对PTEN具有调控作用，Wu等[11]的研究表明，褐藻藻多糖可同时通过miR-29c/ADAM12和miR-17-5p/PTEN两条途径抑制乳腺癌细胞生长，推测miR-17-5p可直接或间接对PTEN进行调控，从而对脑缺血缺氧性损伤产生影响。因此，本研究建立MCAO大鼠模型，探讨miR-17-5p上调/下调对MCAO诱导的脑组织损伤的保护作用，及与PTEN表达水平和相关信号通路活化的关系。

本研究采用经典的线栓法复制MCAO大鼠模型，并对各组大鼠进行神经功能评分,结果发现，模型建立显著降低了大鼠的神经功能，大鼠表现出不同程度的神经症状；与此同时，大鼠脑组织水肿程度明显增加，这与Wang等[23]建立的MCAO模型大鼠表现一致，证明MCAO模型建立成功。为了更为直观地反应MCAO大鼠的脑组织损伤，本研究对脑组织进行了HE染色，证明MCAO模型建立诱导了脑组织神经元细胞发生空泡化、炎症浸润等病理微结构损伤，从结构上阐明了MCAO大鼠神经功能障碍的原因。而miR-17-5p过表达可有效减轻脑水肿、神经功能损伤以及病理微结构损伤，抑制miR-17-5p表达会加剧上述症状。上述试验结果表明，MCAO模型建立诱导了大鼠脑组织结构和功能上的损伤，miR-17-5p能有效改善脑组织的上述变化。

既往研究表明，很多miRNAs在MCAO模型中均表现出调节作用，其机制多是通过靶向调节目的基因来实现[24-25]。为了进一步研究miR-17-5p对MCAO大鼠脑组织产生保护作用的分子机制，本文采用靶向关系预测软件检测发现，miR-17-5p和PTEN存在连续的结合位点，且在MCAO大鼠脑组织中miR-17-5p低表达，PTEN高表达。有研究发现，在使用电针刺激法治疗脑卒中时，PTEN通路相关蛋白和凋亡相关蛋白均受到调节，证明通过抑制PTEN能减轻神经细胞凋亡发生率，从而对神经功能发挥保护性作用[26]。本研究证明，在MCAO大鼠脑组织中，PTEN被miR-17-5p过表达明显抑制，表明miR-17-5p可能通过抑制PTEN而对大鼠脑组织神经功能发挥保护作用。进一步研究发现，通过miR-17-5p靶向抑制PTEN能够有效提高AKT和mTOR磷酸化水平，从而激活AKT/mTOR信号通路；通过miR-17-5p抑制剂抑制miR-17-5p的表达可阻断AKT/mTOR信号通路激活。AKT/mTOR信号通路是细胞增殖、生长、凋亡的关键通路，AKT通过磷酸化活化，进而对下游的各种酶、转录因子等的表达进行调控，对细胞功能进行调节；mTOR是AKT下游的一种对细胞生长和增殖过程至关重要的丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶[27]。Mao等[28]发现，在MCAO模型建立之后的14 d内，PTEN在脑组织中仍保持高表达，PTEN特异性抑制剂BPV可激活AKT/mTOR信号通路，从而促进OGD/R模型细胞的轴突生长，提示PTEN在缺血性脑组织中通过阻断AKT/mTOR信号通路激活而抑制轴突再生。本研究证明，miR-17-5p过表达能通过靶向抑制PTEN而促进AKT/mTOR信号通路的激活，并减轻MCAO大鼠脑组织损伤和减少神经元细胞凋亡，对脑组织缺血性损伤起到保护作用，但其中是否还存在其他病理/生理过程的改变(如自噬程度)或其他信号通路的参与还有待进一步研究。

综上，本研究表明，在MCAO大鼠模型中，miR-17-5p低表达，PTEN高表达，两者存在靶向关系；mimic上调miR-17-5p表达后，大鼠神经功能、脑水肿、脑组织神经元细胞空泡化等病理改变和细胞凋亡率均得到明显改善；miR-17-5p对MCAO大鼠脑组织病理损伤和凋亡抑制的作用与靶向抑制PTEN表达并促进AKT/mTOR信号通路激活有关。本研究旨在为脑卒中等中枢神经系统缺血性疾病的治疗提供试验依据，下一步计划研究miR-17-5p和其他靶基因对MCAO模型脑损伤的保护作用。