酸枣仁皂苷提取工艺的优化及固体饮料产品的研制

（山西中医药大学制药与食品工程学院，山西晋中030619）

酸枣仁为鼠李科植物酸枣的干燥种子，是一种药食同源的常见中药，具有催眠、镇静等功效，在临床中具有良好的治疗与改善失眠状况的效果，酸枣仁也是改善睡眠保健食品开发的常用主要原料之一[1]。酸枣仁中的活性成分包括皂苷、黄酮、生物碱、脂肪酸等，其中酸枣仁皂苷类是发挥镇静催眠作用的主要物质[2]。目前已从酸枣仁中分离出的皂苷类化合物有酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、酸枣仁皂苷A1、酸枣仁皂苷B1、原酸枣仁皂苷A、原酸枣仁皂苷B、乙酰酸枣仁皂苷B等，其中以酸枣仁皂苷A和酸枣仁皂苷B的含量最多。鉴于酸枣仁皂苷的良好改善睡眠功效，致力于提高酸枣仁皂苷提取率的工艺优化方法一直广受关注[3-6]，所涉及到的提取方法有乙醇回流法、超声法、微波法、酶辅助法等。不同的提取方法具有不同的特点，如乙醇回流法经济、简单，但提取时间长，提取率不高；酶法提取率高，但往往需要与其他提取方法复合使用，提取程序稍显复杂；相较而言，超声法与微波法操作简单，提取时间短而提取率较高，是一种省时高效的提取方法。通过进一步优化酸枣仁皂苷的提取工艺，可为后续基于酸枣仁提取物的保健产品开发提供质量一致、活性成分得率较高的原料，具有重要的应用价值。

目前市场中改善睡眠的保健产品主要是以酸枣仁粉末为原料，相应产品多采用口服液、胶囊等药物制剂的形式[1]，以食品形态面市的产品在该领域比重很小，因此亟需开发新型的可用于改善睡眠的酸枣仁精深产品。固体饮料是指含水量很低的粉末、颗粒、片状或块状物，用水冲调即可饮用的一种食品，具有方便、快捷等优点，深受消费者喜爱[7]，市场需求量巨大。本试验采用超声辅助提取酸枣仁中活性物质，通过优化酸枣仁皂苷的提取工艺，以期开发以酸枣仁皂苷提取物为主要成分的固体饮料，一则丰富市场中改善睡眠产品的形式，二则拓宽酸枣仁资源的产业链，为相关从业人员的发展创收提供新出路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酸枣仁：亳州成源中药饮片有限公司，经山西中医药大学中药鉴定教研室鉴定为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa （Bunge）Hu ex H.F.Chou的干燥成熟种子；酸枣仁皂苷A对照品：上海融禾医药科技有限公司；麦芽糊精、柠檬酸：河南万邦实业有限公司；木糖醇：河南圣斯德实业有限公司；蔗糖脂肪酸酯：河南千志商贸有限公司；食品级乙醇：河南鑫河阳酒精有限公司；分析级乙醇：天津市进丰化工有限公司。其余试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

AR423CN型电子天平：美国奥豪斯仪器有限公司；FW177型中草药粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司；ULTRA-3600型紫外-可见分光光度计：北京普源精电科技有限公司；SY-2000型旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；SB-5200DT型超声波清洗机：宁波新芝生物科技股份有限公司；ACQUITY UPLC/Q-TOF Premier型液质联用仪（配有MassLynx V4.1软件工作站）：美国Waters公司。

1.3 酸枣仁总皂苷提取物的制备

1.3.1 提取流程

酸枣仁→粉碎→石油醚脱脂→干燥、过筛→加入提取试剂浸泡30 min→超声提取→过滤→浓缩→提取物浸膏

1.3.2 提取工艺优化的单因素试验

取脱脂酸枣仁粉末5 g，在固定超声功率为200 W的条件下，分别研究乙醇体积分数（40%、50%、60%、70%、80%）、液料比[10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1（mL/g）]、超声温度（20、30、40、50、60 ℃） 和超声时间（15、25、35、45、55 min）4个单因素对酸枣仁皂苷提取率的影响，其中各因素的固定水平为乙醇体积分数70%、液料比 25∶1（mL/g）、超声温度 30℃、超声时间 25 min。

将提取物浸膏用蒸馏水复溶，加入1倍体积的水饱和正丁醇萃取，取正丁醇相蒸干后用甲醇定容至50 mL作为供试溶液。以酸枣仁皂苷A为标准品，参照文献所述的分光光度法进行酸枣仁皂苷含量的测定[8]，以每克酸枣仁粉末中的酸枣仁皂苷含量表示为提取量（mg/g）。

1.3.3 提取工艺的响应面优化

为进一步研究各单因素对提取率的交互影响，以酸枣仁皂苷提取量为指标，在单因素试验基础上，固定超声温度为50℃，确定如表1所示的因素和水平，采用响应面法确定最优的提取工艺。

表1 响应面设计试验因素与水平Table 1 Factors and their levels for response surface design

1.4 酸枣仁提取物的液质分析

利用超高液相色谱-四级杆串联飞行时间质谱（ultra-performance liquid chromatography/quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC-QTOF/MS）对酸枣仁提取物进行成分分析[9]。色谱条件：采用Waters BEH C18（100×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱，以含0.1%甲酸的水溶液（A）和含0.1%甲酸的乙腈（B）为流动相进行梯度洗脱（0～0.5 min，5%B；0.5 min～2 min，5%～15%B；2 min～4 min，15%～20%B；4 min～7 min，20%～35%B；7 min～10 min，35%～60%B；10 min～12 min，60%～85%B；12 min～13 min，85%～100%B；13 min～16 min，100%B；16 min～16.5 min，100%～5%B；16.5 min～18 min，5%B），流动相流速为 0.4 mL/min。质谱条件：电喷雾离子源（ESI），正/负离子模式，离子源温度115℃，毛细管电压2.8 kV，扫描范围m/z 50～1 500，采集时间 0～18 min。

1.5 酸枣仁提取物固体饮料的制备

1.5.1 工艺流程

酸枣仁提取物浸膏→加入适宜辅料→混匀→干燥→粉碎、过筛→混合其他配料→成品

1.5.2 单因素试验

取2 g酸枣仁提取物浸膏，在固定辅料蔗糖脂肪酸酯添加量为0.02 g的前提下，分别研究麦芽糊精用量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g）、木糖醇用量（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g）和柠檬酸用量（0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g）对产品感官的影响，其中各因素的固定水平为麦芽糊精0.4 g、木糖醇0.6 g和柠檬酸0.06 g。产品感官评价是将产品以10倍水冲调后，由10名评价人员按照表2所示的评定标准（满分为100分）进行评分后获得。

表2 感官评价标准Table 2 The standard of sensory score

1.5.3 正交试验

为进一步优化产品配方，在单因素试验基础上，以感官评价为指标，进行三因素三水平的正交试验，得到酸枣仁提取物固体饮料的最佳配方，因素水平表见表3。

表3 正交试验因素水平表Table 3 Factors and levels table of orthogonal test

1.6 酸枣仁提取物固体饮料的理化和卫生指标分析

测定固体饮料的水分含量（参照GB 5009.3-2016《食品安全国家标准食品中水分的测定》中的直接干燥法），分析其菌落总数（参照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》）和大肠菌群指标（参照GB 4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》）。

2 结果与分析

2.1 酸枣仁提取物的制备工艺

2.1.1 单因素试验

各单因素对酸枣仁皂苷提取量的影响见图1。

图1 提取工艺的单因素试验Fig.1 Single factor tests of the extraction process

由图1可知，适当提高提取剂中乙醇的浓度可明显增加酸枣仁皂苷的提取量，且乙醇体积分数为70%时提取量最大，继续增大乙醇浓度提取率会呈下降趋势。这可能与酸枣仁中各类物质的溶解度有关，过高的乙醇体积分数可能更利于其他非皂苷类物质的溶出，从而表现为皂苷提取量的下降。液料比越大越利于酸枣仁皂苷的提取，这是因为提取试剂的增多可加大传质动力，促进固相酸枣仁中皂苷类物质向液相提取试剂中的迁移[10]，因而起初料液比与提取量呈正相关，且液料比为25∶1（mL/g）时提取量最高，之后继续增大液料比提取量未出现明显变化，这可能是由于液料比25∶1（mL/g）时固相中皂苷类物质的溶出已充分，因而即使再增加提取试剂的用量也并未提取到更多的目标物，因而表现为提取量的几乎不变。超声温度对提取量的变化趋势类似于乙醇体积分数，但影响整体偏小，且超声温度为50℃时提取量最高，温度高于50℃反而不利于提取，这是因为适当的增加温度可加快分子运动，促进传质，利于提取；然而当温度过高时，可能会导致三萜类化合物的结构变化[11]，进而影响到其比色检测，因此提取量呈下降趋势，选取50℃作为酸枣仁皂苷的最佳超声提取温度。由图1d可知，超声时间越长，提取量越大，时间为35 min时提取量最高，继续增加提取时间并未提高提取量，说明35 min时皂苷的溶出已基本完全，因而即使延长提取时间也不会提高提取量。

2.1.2 响应面优化

由于超声温度对酸枣仁皂苷提取量的影响整体较小，该部分仅考察了乙醇体积分数、液料比与超声时间3个因素的交互作用，17组试验结果如表4所示。

表4 Box-Behnken试验设计及结果Table 4 Results of Box-Behnken experimental design

对数据进行二次多元回归拟合得回归模型方程为：提取率=7.02+0.27A+0.24B+0.13C-0.041AB+0.22AC-0.093BC-1.22A2-0.38B2-0.32C2。回归方差分析结果见表5。

表5 回归方程的方差分析Table 5 Variance analysis of the regression equation

表5显示模型显著，失拟项不显著，模型可解释97.55%的响应值变化（R2adj=0.975 5），表明模型成立。F值反映出三因素对响应值影响的强弱顺序为：A＞B＞C。一次项A和B对模型的影响极显著，一次项C对模型的影响显著，二次项A2、B2和C2均极显著，交互项AC为显著，说明A、C两因素之间存在交互效应。各因素对酸枣仁皂苷提取量的响应面图见图2。

图2 各因素对酸枣仁皂苷提取量的响应面图Fig.2 Response surface diagrams of the factors on the extraction amount of jujube seed saponins

图2的响应面图可进一步对两因素之间的交互效应作更直观的反映，响应面的坡度反映各因素变化对响应值的影响，而等高线的形状及疏密程度则反映了两因素交互效应的强弱。如图2a中等高线较密集但接近圆形，而图2c中等高线稀疏，说明乙醇体积分数与液料比以及液料比与超声时间两因素之间交互作用不明显，而图2b中等高线呈椭圆形且曲线较密集，说明乙醇体积分数与超声时间两因素交互作用明显，这与方差分析结果一致。根据二次多元回归方程的拟合，得到最佳的提取工艺预测值为：乙醇体积分数71.25%，液料比 26.43 ∶1（mL/g），超声时间 37.12 min，最佳提取量为7.100 0 mg/g。根据实际情况，对条件进行调整，在乙醇体积分数 70%，液料比 25 ∶1（mL/g），超声时间37 min，超声温度50℃的操作条件下进行3次重复提取验证，得到平均提取量为7.094 5 mg/g，与预测值相差不大，说明模型可用于酸枣仁皂苷的提取。

2.2 酸枣仁提取物的液质分析

酸枣仁提取物在正/负离子模式下的总离子流图见图3。

图3 酸枣仁提取物在正离子模式和负离子模式的总离子流图Fig.3 Total ion chromatograms of jujube seed extracts in the positive ion mode and the negative ion mode

通过分析各化合物的色谱保留时间、相对分子质量以及碎片离子信息，并结合文献初步推测出21个色谱峰，结果如表6所示。

提取物中包含10种三萜类（原酸枣仁皂苷A、原酸枣仁皂苷B、酸枣仁皂苷A1、酸枣仁皂苷IV、酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷B、乙酰酸枣仁皂苷B、酸枣仁皂苷B1、麦珠子酸、24-羟基美洲茶酸）、9种黄酮类（斯皮诺素、6’’’-阿魏酰斯皮诺素、新西兰牡荆苷、6’’’-（4""-O-吡喃葡萄糖基）-香草酰斯皮诺素、当药黄素、6’’’-对香草酰斯皮诺素、6’’’-对羟基苯甲酰斯皮诺素、6’’-O-（3-吲哚乙酰葡萄糖）-6’’’-香草酰斯皮诺素、山茶苷B）及2种生物碱类化合物（乌药碱、酸李碱）。这些皂苷、黄酮以及生物碱类成分均被报道具有镇静和催眠作用[14-16]，这为后续所开发产品的功效奠定了科学基础。

表6 酸枣仁提取物的成分鉴定分析Table 6 Identification and analysis of the components of jujube seed extracts

2.3 酸枣仁提取物固体饮料的配方优化

2.3.1 单因素试验结果

配方优化的单因素试验结果见图4。

图4 配方优化的单因素试验Fig.4 Single factor tests for formula optimization

麦芽糊精是淀粉的降解物，甜度较低，接近无味，主要影响体系的黏度，增稠作用明显。麦芽糊精可改善产品的冲调性，提高速溶性。图4a表明，随着麦芽糊精添加量的增加，组织状态、色泽等感官逐渐改善，但添加量过高会带来糊精特有的味道，影响整体口感，因此初步选取0.6 g为麦芽糊精最佳用量。木糖醇是一种天然物质，赋予产品甜味的同时不会增加血糖浓度，是一种理想的添加剂。图4b表明，木糖醇的添加可有效掩盖酸枣仁提取物的苦味，且木糖醇用量为0.8 g时对苦味的中和效果最好，继续增加木糖醇添加量虽然产品没有苦味但是会使得产品过甜，因此初步选取0.8 g为木糖醇最佳用量。图4c反映了柠檬酸用量对产品感官的影响，可见0.04 g的柠檬酸用量时感官评分最高，此时产品酸甜适宜、无苦味，口感最佳；继续增加柠檬酸添加量会使得酸甜不适中，因过酸而导致口感下降。因为酸枣仁提取物本身具有酸苦味，因此本研究所开发的产品中柠檬酸用量较小。

2.3.2 正交试验结果

正交试验结果见表7。

表7 L9（34）正交试验结果Table 7 Results of the L9（34）orthogonal experimental design

方差分析见表8。

表8 方差分析表Table 8 Results of variance analysis

由表7中极差可知，各因素对感官影响大小的顺序为Z＞Y＞X，且最好的组合为X3Y2Z3，即每2 g酸枣仁提取物浸膏中添加有麦芽糊精0.8 g，木糖醇0.8 g，柠檬酸0.06 g。表8的方差分析表显示木糖醇与柠檬酸两个因素对感官的影响显著，麦芽糊精影响不显著，其原因可能是酸枣仁提取物原料本身具有酸苦味，因此可以调和苦味的木糖醇以及影响酸度的柠檬酸用量对产品的口感有极大影响。采用最佳条件进行3组平行试验，产品入口圆润、酸甜适中、分散性好、色泽均匀、呈淡黄色，具有酸枣仁特有的淡淡香气，无异味，平均感官评分为87分。

2.4 酸枣仁提取物固体饮料的质量分析

所制得固体饮料的水分含量为4%，菌落总数＜1000 CFU/g，大肠菌群未检出，符合产品标准要求。

3 结论

本研究通过单因素结合响应面法优化了酸枣仁皂苷的提取工艺，得到最佳提取工艺为：超声功率200 W、超声温度为50℃、超声时间为37 min、乙醇体积分数为 70%、液料比 25 ∶1（mL/g），提取量为 7.094 5 mg/g。采用液质联用对提取物成分进行了分析，推测出其中含有10种三萜类、9种黄酮类和2种生物碱类化合物，这些化合物被揭示具有镇静和催眠的功效。进而以酸枣仁皂苷提取物为原料，配以其他辅料制作了一款固体饮料，通过单因素试验和正交分析，得到产品的最佳配方为：酸枣仁提取物2 g，麦芽糊精0.8 g，木糖醇0.8 g，柠檬酸0.06 g，蔗糖脂肪酸酯0.02 g。产品口感好，具有酸枣仁特有的风味，且食用与携带方便，具有良好的开发前景。