石淋通片中3个黄酮类成分含量测定

蔡安妮 何海霞 罗兰

摘      要：建立了石淋通片的质量控制方法。采用UV法测定石淋通片的总黄酮含量，HPLC法测定石淋通片中夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素的含量。色谱柱为Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），用甲醇-2.5 mmol/L醋酸铵溶液作为流动相，梯度洗脱，检测波长为340 nm;流速为1 mL/min。经验证，石淋通片的总黄酮含量在6.989～7.261 mg/g;夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素的线性关系良好，易于操作，仪器的精密度、样品的稳定性和重现性良好，平均加样回收率均在95%～105%之间。石淋通片中夏佛塔苷的最低含量为1.95 mg/g，异夏佛塔苷最低含量为0.80 mg/g，异牡荆素的最低含量为0.21 mg/g。该方法准确可靠，重复性好，可用于石淋通片的质量标准研究。

关  键  词：石淋通片;总黄酮;夏佛塔苷;异夏佛塔苷;异牡荆素;含量测定

中图分类号：R284.1       文献标识码：R       文章编号： 1671-0460（2020）03-0745-04

Content Determination of Three Flavonoids in Shilintong Tablets

CAI An-ni， HE Hai-xia， LUO Lan^*

（Xinhua College of Sun Yat-sen University， Guangdong Guangzhou 510520， China）

Abstract： The quality control method of Shilintong tablet was established. UV method was used to determine the total flavonoids content of Shilintong tablet. The contents of schaftoside， isophtalin and isovitexin in Shilintong tablet were                     simultaneously determined by HPLC with the Eclipse XDB-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5μm）using methanol-2.5 mmol/L ammonium acetate as mobile phase at the rate of 1 mL/min under the detection wavelength of 340 nm. After methodological verification， the total flavonoids content of Shilintong tablet was 25.78～26.56 mg/g，the calibration curves were linear for schaftoside， isophtalin and isovitexin.The precision of the instrument， the stability and reproducibility of the sample were good. The average recovery was 95%～105%.The minimum contents of schaftoside， isophtalin and isovitexin in Shilitong tablet were 1.95 mg/g， 0.80 mg/g and 0.21 mg/g，respectively. The method is accurate and has good repeatability. It can be used to research the quality standard of Shilintong tablet.

Key words：  Shilintong tablet;  total flavonoids;schaftoside;  isophtalin;  isovitexin;  content determination

石淋通片為广金钱草提取物的单方制剂，具有清热利尿、抗氧化、抗炎、碱化尿通淋排石之功效，常用于湿热所致的热淋、石淋，出现尿频、尿痛、尿路结石、肾盂肾炎症状的患者^[1，2]。现代研究表明，广金钱草中的主要活性成分是黄酮类化合物，其中含量较高并且具有明显药理作用的是夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素3种黄酮类成分^[3，4]。2015版中国药典对广金钱草中的夏佛塔苷成分做出了含量测定的规定，但却未对石淋通片中的指标成分进行含量测定，而且这种单一的质量控制模式存在较大的缺陷。依据本研究的前期工作基础，采用高效液相色谱方法研究建立了同时测定广金钱草中3种黄酮类成分夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素的方法^[5-7]，可为石淋通片的质量控制提供一定实验的依据。

1  实验部分

1.1  仪器

高效液相色谱仪（Agilent 1100 系列，美国安捷伦科技公司，含有四元梯度泵、二级管阵列检测器、紫外检测器、Chemstation 工作站），电子天平FA2004N（上海精密仪器有限公司），电热恒温水浴锅（上海福玛实验设备有限公司），UV-1102型紫外分光光度计（上海天美科学仪器有限公司）、超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2  试药

芦丁对照品（纯度≥98%，酷尔生物，批号：B154199）、夏佛塔苷对照品（纯度>98%，成都瑞芬恩生物科技有限公司）、异夏佛塔苷对照品（纯度>98%，成都瑞芬恩生物科技有限公司）、异牡荆素对照品（纯度>98%，上海融禾医药科技有限公司），石淋通片（广东万年青制药有限公司）。甲醇为色谱纯，亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯。

2  实验方法与结果

2.1  石淋通片总黄酮的含量测定

2.1.1  对照品溶液的制备

精密称取在120 ℃下干燥至恒重的芦丁标准品12 mg，置于50 mL量瓶中，加入60%乙醇适量，置水浴上微热溶解，放冷，以60%乙醇稀释至刻度，摇匀。

2.1.2  供试品溶液的制备

取本品10片（糖衣片为20片，除去包衣），研细，混匀，取供试品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇 25 mL，称定重量，超声处理（功率100 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用80%甲醇补足减失的重量，摇匀滤过，滤液蒸干，残渣加50%甲醇适量使溶解，转移至25 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3  测定波长的选择

精密量取对照品溶液3 mL，置25 mL量瓶中，加30%乙醇6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1mL，摇匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，按紫外分光光度法进行扫描，显示在511 nm处有最大吸收，确定检测波长为511 nm。

2.1.4  标准曲线的绘制

精确量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL分置于25 mL量瓶中，各加30%乙醇6.0 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，摇匀，放置6 min，再加10%硝酸铝溶液1 mL，摇匀，放置6 min。加氢氧化钠试液10 mL，再加30%乙醇至刻度，摇匀，放置15 min，以相应试剂为空白，在511 nm 波长处测定吸光度，以浓度（C）为纵坐标，吸光度（A）为横坐标，绘制标准曲线，得回归方程为：

A=15.841C-0.007 1，R²=0.999 9

2.1.5  精密度试验

精密吸取对照品溶液3 mL，按2.1.4方法显色，连续测定6次吸光度，计算 RSD为0.22%，结果表明仪器精密度良好。

2.1.6  稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（150931）3 mL，按2.1.4方法显色，于室温放置0、10、20、30、40 min测定吸光度，代入标准曲线并计算含量，其含量的RSD为1.74%，结果表明，供试品在40 min内测定稳定。

2.1.7  重复性试验

取本品同一批样品（150931）6份，按2.1.2方法平行制备供试品溶液，分别取3 mL，按2.4项下方法显色， 测定吸光度，代入标准曲线并计算含量，其含量的RSD为1.35%。结果表明，此法重复性良好。

2.1.8  加样回收率试验

精密称取已知含量的石淋通片（S3）6份， 各2.0 g， 精密称定。分别精密加入14.26 mg芦丁对照品，加甲醇补足25 mL，按2.2项下方法制备供试品溶液，取3 mL，按2.4方法显色测定，计算回收率为100.26%，RSD值为0.74%，见表1。

2.1.9  样品含量测定

取3批广金钱草样品，按2.2项中所述的方法制备供试品溶液，精密吸取3 mL，按2.4方法显色，测定吸光度，代入标准曲线并计算含量，测定结果见表2。

結果表明，3批石淋通片的总黄酮的含量在6.989～7.261 mg/g之间，RSD为1.91%

2.2  HPLC同时测定夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆素的含量

2.2.1  色谱条件

色谱柱为Eclipse XDB-C₁₈柱（250 mm×4.6 mm，5μm），以甲醇-2.5 mmol/L醋酸铵溶液作为流动相，梯度洗脱：0～20 min，甲醇占比为30%→40%; 20～35 min，甲醇占比为40%→55%;35～45 min，甲醇占比为55%→70%;检测波长为340 nm;流速为1 mL/min。

2.2.2  对照品溶液的制备

精密称取对照品夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素适量，用甲醇分别溶解，均制成浓度为20 mg/mL的对照品溶液。分别精密量取各对照品溶液0.4、0.8、1 mL于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成含0.8 mg/mL的夏佛塔苷，1.6 mg/mL的异夏佛塔苷，2 mg/mL异牡荆素的混合对照品溶液。

2.2.3  供试品溶液的制备

取本品10片（糖衣片为20片，除去包衣），研细，混匀，取供试品约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入60%甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，取出，放冷，滤过，取续滤液，滤液再经微孔滤膜（0.45μm）滤过，即作为供试品溶液^[8]。

2.2.4  线性关系考察

精密量取按“2.2”方法配制的对照品贮备液0.05、0.1、0.5、1、1.5、2.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。按2.1色谱条件分别进样，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制图标并计算回归方程，结果见表3。

实验结果表明：夏佛塔苷在0.10～4.00 μg（R²= 0.999 8 ）内线性关系良好，异夏佛塔苷在0.08～3.20 μg （R²=0.999 7 ）内线性关系良好，异牡荆素在0.04～1.60 μg （R²=0.999 9 ）内线性关系良好。

2.2.5  精密度试验

精密吸取10 μL同一混合对照品溶液，平行进样6次，按上述色谱条件进行检测。可得结果，3种黄酮类成分夏佛塔苷的峰面积RSD值为0.27%、异夏佛塔苷的峰面积RSD值为0.29%和异牡荆素的峰面积RSD值为0.34%，故可得仪器精密度良好。

2.2.6  稳定性试验

精密吸取同一供试品溶液（150521）于0、2、4、8、12、16 h 连续进样6次，每次进样量为10 μL，按2.1项中的色谱条件进行检测，记录峰面积。结果得到3种黄酮类成分夏佛塔苷峰面积RSD值为1.39%、异夏佛塔苷峰面积RSD值为1.16%和异牡荆素的峰面积RSD值为2.72%，从以上结果可得样品稳定性良好。

2.2.7  重复性试验

取同一批石淋通片样品（150521）6份，每份10片（糖衣片为20片，除去包衣），研细，混匀，取约0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶，精密加入60%甲醇25 mL，称重，超声处理30 min，取出，放冷，滤过，取续滤液，滤液再经微孔滤膜（0. 45μm）滤过，按此法平行制备供试品溶液6份，按2.1项中的色谱条件进行检测，测定夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素成分的含量，可得RSD值分别为4.22%、4.09%和2.26%，表明该方法重复性良好。

2.2.8  加样回收率试验

取6份，已知成分含有量的同一批石淋通片样品（150521），精密称定，每份0.25 g，并分别加入0.505 mg/mL的夏佛塔苷对照品溶液1 mL、0.202 mg/mL的异夏佛塔苷对照品溶液1 mL和0.052 mg/mL的异牡荆素对照品溶液1 mL，置25 mL量瓶用，甲醇稀释至刻度，按2.3项中同样的方法制备供试品溶液，按2.1项中的色谱条件进行检测，计算平均回收率。见表4。

结果夏佛塔苷的平均回收率为100.43%，异夏佛塔苷的平均回收率为100.57%，异牡荆素的平均回收率为96.76%。

2.2.9  样品含量测定

取3批石淋通片样品（批号150931、150521、150312），每批3份，每份约0.5 g，按2.3项中相同方法制备供试品溶液，按上述相同色谱条件进行检测，记录本品中三个黄酮类成分（夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆素）的峰面积，按外标法计算，测定结果见表5。

由以上结果可知，夏佛塔苷的最低含量为1.95 mg/g，异夏佛塔苷最低含量为0.80 mg/g，异牡荆素的最低含量为0.21 mg/g。

3  讨 论

3.1  对照品的选择

据报道，广金钱草含有的黄酮类成分很多（夏佛塔苷、异夏佛塔苷、异牡荆苷等），不宜用其中一种成分的对照品直接进行总黄酮的含量测定。因芦丁是比较常用的总黄酮类标样，因此采用芦丁对照品作为总黄酮的紫外分光光度法测定含量的标样。

3.2  样品的处理

本试验参考有关资料[2，3]， 样品用60%甲醇超声提取， 并考察了超声提取时间对样品中夏佛塔苷提取的影响， 结果用60%甲醇超声处理20、30 、45 min 测定结果相近。为确保提取完全， 故选择超声处理30 min。在芦丁对照品和石淋通片的紫外检测波长扫描中。在390 nm处有一较大的吸收峰，对390 nm吸收峰的机理仍不明确，需进一步研究。

3.3  实验结果分析

在《中国药典》2015年版一部中，石淋通片无含量测定项目。本文在广金钱草3种成分含量测定的基础上，对石淋通片的夏佛塔苷、异夏佛塔苷和异牡荆素3种黄酮类成分也作了检测，发现同一药厂生产的不同批次的样品，夏佛塔苷的最低含量为1.95 mg/g，异夏佛塔苷最低含量为0.80 mg/g，异牡荆素的最低含量为0.21 mg/g，各指标成分的含量差别不大，质量相对稳定。

本试验建立的采用UV测定石淋通片总黄酮的含量及HPLC同时测定石淋通片中3种黄酮类成分含量的方法，方法准确可靠，精密度良好。此方法能够快速地检测石淋通片中3种黄酮类成分含量，可为石淋通片的质量控制提供一定的实验依据。

参考文献：

[1] 王鑫. 广金钱草中黄酮类化合物定性分析及其抗大鼠肾草酸钙结石作用的研究[D].河北医科大学，2018.

[2] 张子婷，钟轻娇，周碧瑶，等.广金钱草总黄酮的提取方法及药理作用研究进展[J].中国中医药现代远程教育，2019，17（08）：107-110.

[3] 钟鸣，柴玲.广金钱草化学成分及药理作用研究进展[J].广西医学，2018，40（01）：80-82+91.

[4] 蘇亚伦，王玉兰，杨峻山.广金钱草黄酮类化学成分的研究[J].中草药，1993，24（07）：343-344+378+388.

[5] 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）[M].北京：中国医药科技出版社，2015.

[6] 罗兰，谭结凤，钱浩，等.HPLC同时测定广金钱草中3种黄酮类成分含量[J].广东化工，2019，46（02）：179-180.

[7] 张子婷，钟轻娇，周碧瑶，等.广金钱草总黄酮的提取方法及药理作用研究进展[J].中国中医药现代远程教育，2019，17（08）：107-110.

[8] 陈乾平，谷筱玉，龙海荣，等.不同产地鸡血藤药材中芒柄花素及总黄酮的含量测定[J].当代化工，2016，45（07）：1549-1552.