海洋石油降解菌Pseudoalteromon SI-JHS发酵条件的优化

张爱君，程鹏高，唐 娜*，曹军瑞

(1.天津科技大学 化工与材料学院，天津 300457；2.自然资源部天津海水淡化与综合利用研究所，天津 300192；3.天津市卤水化工与资源生态化利用重点实验室，天津 300457)

随着我国经济的迅猛发展，对能源特别是石油的需求量日益增长，但石油在开采、炼制、运输和储存过程中发生的海上溢油事故时有发生，加剧着石油对海洋环境的威胁[1-2]。目前常用的治理海上溢油污染的方法主要有物理方法、化学方法和生物方法三种方法。与物理化学修复手段相比，生物修复具有成本低、无二次污染、处理效果好等优点，在诸多含油海水处理方法中被认为是最有应用前景的处理技术[3]，并已有生物修复法治理石油污染的实例[4]。目前，已报道的石油降解菌有数百种，涉及数十个属[5]，如芽孢杆菌(Bacillus)、假单胞菌(Pseudomonas)、脱硫菌(Desulfosarcina)、红球菌(Rhodococcus)等[6-9]。由于海水较高的盐度制约着石油降解菌的生长及降解效率，传统的非耐盐菌株并不适合对高盐环境进行生物修复。因此，海洋来源的耐盐石油降解菌在海上溢油处理中具有更好的应用前景[10]。

本课题组在前期的研究中，从渤海入海口的泥沙中分离获得一株可降解石油的菌株SI-JHS，鉴定为假交替单胞菌(Pseudoalteromonsp.)，能够以石油为唯一碳源。本研究以SI-JHS为出发株，采用Plackett-Burman设计法和响应面分析法[11]对石油降解菌SI-JHS降解石油的发酵培养基进行优化，确定培养基主要影响因子及其最佳添加量，为海洋溢油的生物降解提供前期技术支持。

1 材料与方法

1.1 菌种

海洋石油降解菌SI-JHS(Pseudoalteromon sp.)为本实验室保存，筛选自渤海入海口处的修船厂滩涂。

1.2 培养基

种子培养基：蛋白胨 10 g/L，酵母粉 5 g/L，NaCl 10 g/L，pH 值7.0，固体培养基添加1.5%～2%琼脂粉。该培养基用于菌株的保存和传代培养。

初始发酵培养基：NaCl 35.0 g，K2HPO41.0 g，KH2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NH4NO31.0 g，酵母提取物 0.01 g，蒸馏水补足1 L，pH值7.5。121 ℃，高压灭菌20 min。石油含量1 g·L-1。

1.3 实验设计和方法

1.3.1 菌株的活化

将保存的海洋石油降解菌SI-JHS转接于LB固体培养基，30℃培养2 d。挑取单菌落接种到LB液体培养基中，30℃，160 r/min摇床培养过夜，按1%接种量将种子液转接到发酵培养基中，进行条件摸索试验。

1.3.2 Plackett-Burman实验

采用Design expert 软件，选择石油降解菌SI-JHS培养基中的5个因子，进行Plackett-Burman实验设计，考察石油降解率。实验各因素的水平设置见表1。

表1 Plackett-Burman实验因素编码及水平

1.3.3 最陡爬坡实验

根据Plackett-Burman试验筛选出的显著影响因子的正负效应，设计最陡爬坡实验路径和步长，使生物表面活性剂产量逼近最佳值反应区域[12]。

1.3.4 响应面分析

利用Design-Expert8.06软件进行2因子3水平Central Composite Design的中心组合试验设计，确定显著因子的最佳水平。

1.3.5 石油降解率测定

采用紫外分光光度法绘制石油含量的标准曲线[13]。试管中加入50 μL硫酸溶液进行酸化，加1 mL正己烷萃取，萃取液转移至25 mL离心管， 160 r/min震荡 2 min，10000 r/min离心3 min，测定其上层液体于波长227 nm处的吸光度(以A1表示)。同时以未加菌株的筛选培养基为空白对照，测定其上层液体于波长227 nm处的吸光度(A0)，将吸光度带入石油标准曲线，计算石油含量(C0为空白对照石油油含量，C1为降解后残余石油含量)。降解活性以降解率表示：

2 结果与讨论

2.1 Plackett-Burman实验

采用初始发酵培养基培养海洋石油降解菌SI-JHS时，石油降解率可达到70%。在此基础上优化培养基组分。以发酵培养基5种成分作为5各因素，选用实验次数为N=12的实验方法进行PB实验设计，X1、X3、X5、X7、X9分别代表磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸镁、硝酸铵、酵母提取物，设计X2、X4、X6、X8、X10空白作为误差分析项。每个因素分别选取了高水平(+1)和低水平(-1)，以石油降解率作为响应值。PB实验设计和响应值见表2，每个实验设两个平行样，结果取平均值。

表2 Plackett-Burman实验设计和响应值

利用Design-expert8.06软件对PB试验结果进行方差分析，由石油降解率影响因素主效应分析结果见表3。

表3 石油降解率影响因素主效应分析结果

由表3可以看到，回归模型的P值为0.0053(P<0.05)，说明该模型显著，在整个的实验数据区间内拟合较好。各变量对响应值影响显著性油F值检验来判定，P值越小，响应变量的显著程度越高。培养基中各因素对石油降解率影响效应大小顺序依次为：硝酸铵>硫酸镁>磷酸氢二钾>磷酸二氢钾>酵母提取物，其中硝酸铵(P=0.0005)、硫酸镁(P=0.0201)是主要的影响因子(P<0.05)，其他因素对发酵液表面张力变化影响不显著。因此，选择硝酸铵和硫酸镁这两个因素进行更深入的研究。

2.2 最陡爬坡实验

表4 最陡爬坡实验设计和结果

分析Plackett-Burman实验结果确定硝酸铵和硫酸镁为主要的影响因素，硫酸镁对石油降解率起负效应，即硫酸镁浓度越高，石油降解率越小。硝酸铵对石油降解率影响为正效应，提高硝酸铵的含量，可以提高石油降解率。根据PB实验结果，确定两个影响因子的实验范围和爬坡步长，设计最陡爬坡路径(表4)。

通过表4实验结果可以看出，石油降解率变化趋势为先升高再下降，在第8组实验中石油降解率最大，因此选择第8组实验的各因素作为响应面实验的中心点，即硫酸镁0.75 g/L，硝酸铵2.0 g/L。

2.3 响应面分析

根据PB实验和最陡爬坡实验结果，对2个影响显著的因子硫酸镁和硝酸铵进行中心组和设计结合响应面分析，以确定他们的最佳值，获得最佳石油降解效果。实验因子水平及编码见表5，共计13组实验，磷酸二氢钾，磷酸氢二钾、酵母提取物浓度分别为1 g/L，1 g/L，0.01 g/L。

表5 中心组和设计及结果

以石油降解率为响应值，Design of experiments8.06软件分析实验数据，结果如表6所示。

表6 方差分析

对中心组和设计确定的各参数取值范围进行响应面分析，结果如图1所示。

图中显示硫酸镁和硝酸铵对石油降解率的交互影响的三围曲面图和相应等高线图，回归模型的最佳值存在响应面最低点，等高图的圆心。通过Design of experiments8.06软件计算，得出发酵液表面张力最低时培养基成分为：氯化钠35 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.89 g/L，硝酸铵2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L，在此优化条件下，发酵液的对石油降解率达到80.5%。

图1 硫酸镁和硝酸铵交互影响的三维曲面图和相应等高线图

2.4 摇瓶发酵优化试验结果验证

为了验证理论值与实验值的符合性，按照优化后发酵培养基配方对菌株SI-JHS发酵液对降解效果进行验证实验，实验测得平均降解率为80.8%，与预测值基本符合，证实了模型的有效性。

3 结论

海洋来源的石油降解菌在海上溢油的生态修复技术方面具有良好的应用前景。本研究利用Plackett-Burman实验对菌株SI-JHS降解石油的培养基组分进行优化。结果表明，硝酸铵和硫酸镁为显著影响因子，通过最陡爬坡实验和中心组和设计实验，建立硝酸铵和硫酸镁的二次回归方程，经验证实验证明了该模型可靠性，最终获得海洋石油降解菌SI-JHS降解石油的最佳培养基配方为：氯化钠35 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.89 g/L，硝酸铵2.11 g/L，酵母提取物0.01 g/L。使用优化条件培养海洋石油降解菌SI-JHS，石油降解率为80.8%，与预测值接近，比优化前提高了14.2%。