SBA-15固定化漆酶及其稳定性研究

夏 峰

(南京医科大学康达学院，江苏 连云港 222000)

酶催化具有高效、专一、作用条件温和及环境友好等显著特点，因此被广泛应用于医药、化工、食品、轻工和环境保护等行业[1]。虽然酶具有如此优越的性能，但游离酶稳定性差、不易分离、难于回收，因而其应用受到一定限制，而酶的固定化可以很好的解决这一问题，使其具有更广阔的应用空间[2-4]。漆酶是含有四个铜离子的多酚氧化酶，属单电子氧化还原酶，来源广泛，具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳定性，被广泛应用于生物漂白、废水处理、有机合成、燃料电池、生物传感器构建和药物生产等方面[5-8]。SBA-15是一种水热稳定性高，孔径大的介孔材料，对于固定大分子的酶具有一定优势[9-10]。本文以大孔径SBA-15为载体，通过吸附漆酶制备了一种固定化漆酶，该固定化漆酶表现出良好的操作稳定性，具有一定应用价值。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

pH计，准微量天平，水平摇床，离心机，Biomate 3S紫外分光光度计。

1.2 试剂

磷酸二氢钠·二水，磷酸氢二钠·十二水，2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(以下简称ABTS)，漆酶，SBA-15分子筛。

2 实验方法

2.1 漆酶的固定化

将0.05 g的SBA-15(BET比表面积≥800 m2/g，孔径 6～10 nm)分子筛悬浮于5 mL含有一定浓度漆酶的0.2 mol/L磷酸缓冲液中，在水平摇床上以160 r/min的转速反应20 h，然后离心分离出固体，并用磷酸缓冲液洗涤固体至上清液中检测不到酶活，即得到需要的固定化漆酶。

2.2 酶活性的测定

游离漆酶活性的测定：以1.0 mmol/L的ABTS溶液为底物，取一定浓度的漆酶溶液与ABTS溶液进行等体积反应，反应体系为适当pH值的0.2 mol/L磷酸缓冲液，然后用Biomate 3S紫外分光光度计测定反应体系4 min内420 nm处的吸光度变化，吸光度变化越大，酶活越高，每分钟使1 μmol的ABTS氧化所需的酶量定义为一个酶活单位。

固定化漆酶活性的测定：取0.05 g固定化漆酶，加入2 mL适当pH值的0.2 mol/L磷酸缓冲液和1 mL 1.0 mmol/L的ABTS溶液，反应5 min后置于冰水浴中停止反应，离心分离，测上清液在420 nm处的吸光度，每克载体每分钟使1 μmol的ABTS氧化所需的酶量定义为一个酶活单位。

3 结果与讨论

3.1 游离漆酶的最适pH值及pH稳定性

图1是不同pH值下游离漆酶催化ABTS反应体系的吸光度变化随时间的变化关系，由于酶活性与吸光度变化值成正比，所以吸光度变化越大，酶活越高。从图1可以看到，反应体系的吸光度值随着反应时间的进行不断增大，但不同pH值下吸光度的变化速度不同，当pH值为3时，反应体系的吸光度值变化最快，说明此时漆酶的活性最高，所以游离漆酶的最适pH值为3左右。

图1 pH值对漆酶活性的影响

将游离漆酶在pH值为2～6的磷酸缓冲液中分别放置20 h后，测定酶的剩余活性，即可表示漆酶在不同pH值下的稳定性，结果如图2所示。从图中可以看到，放置20 h后，与新鲜漆酶的活性相比，反应体系4 min后的吸光度值，即漆酶活性均发生了一定的变化，不同的是，pH值越低，酶活下降越多，而pH值越高，酶活则比较稳定，但总体上看pH值为3.5时漆酶表现出最高的吸光度值。

图2 pH值对漆酶稳定性的影响

3.2 给酶量对漆酶固定化的影响

用pH值为3.5的磷酸缓冲液配制不同浓度的漆酶溶液，分别在SBA-15上固定20 h，测得不同给酶量(漆酶与载体的质量比)下固定化漆酶的活性，结果如图3所示，固定化漆酶的活性随着给酶量的增大先升高，当给酶量为48 mg/g时，固定化漆酶的活性最高，继续增大给酶量，固定化漆酶的活性反而有所降低，这可能是因为负载于SBA-15分子筛孔道内的漆酶分子过多，影响了反应过程中物质的扩散与传输效率。

图3 给酶量对固定化漆酶活性的影响

3.3 固定化漆酶的操作稳定性

与游离漆酶相比，固定化漆酶可以重复利用，经过反复8批次的反应，结果如图4所示。从图中可以看到，第1批次反应后，固定化漆酶的活性有所下降，可能是一些与载体结合较弱的漆酶在反应中被洗脱，第5批次反应后，固定化漆酶的活性又有所下降，可能是操作过程中固体反复使用有所损失造成的。尽管如此，经过8批次的反应后，固定化漆酶的剩余活性仍然达到85%以上，表现出较好的操作稳定性，具有一定的应用价值。

图4 固定化漆酶的操作稳定性

4 结论

SBA-15介孔分子筛是一种具有大比表面积和丰富孔道结构的无机材料，机械强度高，水热稳定性好，是进行酶固定化的优异载体。本研究结果表明，通过物理吸附法，漆酶可以固定于SBA-15的孔道内，在pH值为3.5，给酶量为48 mg/g时，可以得到性能较佳的固定化漆酶。与游离漆酶相比，固定化漆酶经过8批次的反应后，剩余活性仍然达到85%以上，表现出良好的操作稳定性，具有一定的应用价值。