黏蛋白MUC5B启动子rs35705950多态性与特发性肺纤维化易感性的研究*

苟安栓，吴长东，汪海涛，常峪文，周明明

（新疆维吾尔自治区人民医院 1.呼吸与危重医学二科，2.重症医学一科，3.健康管理中心，新疆 乌鲁木齐 830001）

特发性肺纤维化（idiopathic pulmonary fibrosis,IPF）是一种进行性纤维化的肺部疾病，多发于老年人，且病变部位局限于肺部，目前病因未明，生存期约3～5年，预后较差[1]。肺纤维化是一种二次打击疾病，环境暴露与宿主遗传相互作用导致肺损伤，目前认为多种基因在IPF 发病过程中起重要作用。其中黏蛋白基因MUC5B启动子rs35705950 G＞T 多态性被认为是与IPF 发病相关的重要遗传因素[2]。目前在高加索人群（意大利、法国、英国）[3-5]、中国汉族部分人群[6]已有报道，但结果不完全一致。本文采用PCR-直接测序法对新疆地区维吾尔族患者MUC5B启动子rs35705950 位点基因多态性与IPF 发病的相关性进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本研究采用基于人群的病例-对照的研究方法，参照2011年ATS/ERS/JRS/ALAT 联合发布的《特发性肺纤维化诊疗指南》中的临床诊断标准[7]，选取2015年 6月—2018年6月新疆维吾尔自治区人民医院呼吸科与重症医学二科确诊维吾尔族IPF 患者88 例为IPF 组。其中，男性53 例，女性35 例；年龄58～77 岁，平均（66.92±5.80）岁；除外已知的继发性肺纤维化、肿瘤、结核病，以及自身免疫性结缔组织疾病相关的间质性肺炎。对照组88 例，纳入标准：与IPF 1∶1 配对的新疆地区维吾尔族人群，性别相同；年龄55～80 岁，平均（66.30±6.06）岁；无间质性肺疾病病史，主要来自急诊或门诊就诊及健康管理中心体检的无慢性疾病患者。

1.2 方法

IPF 组与对照组患者分别抽取外周静脉血3 ml，置于含有2%乙二胺四乙酸二钠（EDTA）100 μl的一次性试管中，用于DNA 抽提；置于-20℃冰箱冷冻保存，常规酚-氯-仿-异戊醇抽提法提取基因组DNA。采用PCR-直接测序法检测MUC5B 启动子rs35705950 G＞T 多态性，扩增引物序列参照文献[6]，NCBI Accession：1241221，正向引物5'-GC CCATCCCTGCTTTGTG-3'，反向引物5'-CACCTCTGCA TCAGCGAGATAG-3'。PCR 反应总体积25 μl，配置如下：正向引物1.5 μl，反向引物1.5 μl，10×PCR 反应 缓冲液[含（NH4）SO4]2.5 μl，dNTP mixture 1.2 μl，Taq DNA聚合酶0.2 μl，DNA模板2.0 μl，2.5 μl MgCl2。PCR 扩增程序：94℃预变性5 min，94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，最后3 个步骤，共35 个循环，最后72℃继续延伸5 min。PCR 扩增片段976 bp。PCR 产物送鼎国生物技术股份有限公司进行DNA 测序。

1.3 统计学方法

数据分析采用SPSS 19.0 统计软件，计数资料以例或例（%）表示，基因型分布是否符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律及两组间基因型和等位基因频率分布的差异比较采用χ2检验。计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验。计算比值比（O^R）和95%可信区间（95% CI）评价突变基因型及突变等位基因频率与IPF 的相对危险度。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组人群分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡

MUC5B启动子rs35705950 位点各种基因型在IPF 组和对照组人群的分布符合Hardy-Weinberg 遗传平衡（P＞0.05），具有群体代表性。

2.2 两组年龄、性别和吸烟史的比较

两组年龄、性别比较，差异无统计学意义（年龄：t=0.699，P=0.485，性别：χ2=0.000，P=1.000）；IPF组有吸烟史48 例，对照组有吸烟史52 例，两组比较，差异无统计学意义（吸烟史：χ2=0.371，P=0.543）。

2.3 MUC5B 启动子rs35705950 G＞T 多态性及PCR-直接测序分析结果

MUC5B启动子rs35705950 G＞T 多态性及PCR-直接测序分析结果见图1。

2.4 MUC5B 启动子rs35705950 G＞T 基因型、等位基因频率及发生IPF 相对危险度分析结果

IPF 组与对照组中的GT 突变基因型和野生GG基因型构成比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；两组等位基因G 和等位基因T 的差异，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

图1 MUC5B 启动子rs35705950 G＞T 多态性

表1 两组MUC5B 启动子rs35705950 基因型、等位基因的分布及相对危险度 例（%）

3 讨论

IPF 是一种以增强的细胞外基质沉积为特征，进行性、最终致命的慢性间质性肺病[8]。肺纤维化是基因调控（异常肺泡上皮细胞周期的基因调控及细胞凋亡）与环境压力相结合的遗传倾向，包括暴露于已知的纤维材料[9-10]，因此认为遗传因素在间质性肺疾病发生中可能起重要作用。研究发现，位于MUC5B启动子的SNP（rs35705950）被证实与家族性肺间质病和IPF相关性最强，存在于34%的家族性肺间质病和38%的IPF，仅有9%存在于正常对照，并被认为是这2 种疾病的危险等位基因[4]。

目前研究证实，黏蛋白基因MUC5B在气道黏液纤毛清除、调节气道炎症、防御肺部感染方面发挥重要保护作用[11]。PLANTIER 等[12]对IPF 时细支气管末端气腔特征进行了从形态学到转录因子及信号传导系统相关性的一系列研究，发现MUC5B表达失控参与肺纤维化的形成。该研究发现，在肺组织中rs35705950 明显导致IPF 患者高表达MUC5B免疫组织化学染色显示在IPF 时，黏蛋白基因MUC5B在微小蜂窝组织部位积聚，蜂窝囊壁化生的上皮细胞内也有补丁样染色，同时在蜂窝囊腔中有黏液栓沉积。而过多的黏蛋白基因MUC5B潴留在肺泡和蜂窝组织内会损害宿主的防御功能，从而导致因吸入物质沉积，肺清除能力下降而引起的肺损伤，另外，过多的黏蛋白基因MUC5B在呼吸性细支气管末端沉积会影响损伤肺泡的修复，正常肺泡的修复机制失败，最终持续胶原沉积，瘢痕形成，肺结构破坏，随着时间的推移，最终导致终末期肺纤维化的组织重塑和纤维化。

MUC5B基因位于染色体11p15 的保守簇，主要调控气道黏蛋白MUC5B合成。一项来自美国华盛顿大学对1 例临床确诊IPF 的61 岁欧美男性患者尸体全基因组测序研究发现，在MUC5B启动子区并未发现除rs35705950 以外其他相邻的序列变异，也未发现其他稀少及新发现遗传性变型。rs35705950 位于MUC5B启动子区，干扰DNA 酶与转录因子结合位点，上调MUC5B表达。表明MUC5B启动子区单核苷酸多态性可能是与IPF 发病相关的重要遗传因素[2]。BORIE 等[3]报道一项包括法国、意大利人在内的前瞻性队列研究及Meta分析结果，MUC5B启动子G＞T多态性与IPF 发病相关。WANG 等[6]对163 例IPF 患者MUC5B启动子G＞T 多态性分析，结果显示我国汉族人群IPF 患者中，T 等位基因的频率为3.33%，高于正常对照组，分层分析显示，该变异与中国老年男性IPF 患者遗传易感性相关。

本文通过采用PCR-直接测序的方法对，按照1∶1 配对IPF 组与对照组进行MUC5B启动子位点基因多态性与IPF 发病的相关性进行初步探讨。结果显示，两组的GT 突变基因型和野生GG 基因型构成差异无统计学意义，两组等位基因G 和T 差异无统计学意义。诚然，本研究存在一定局限性，样本量偏少，且未进一步设立非IPF 特发性间质性肺炎对照研究，今后将进一步扩大样本量，并从IPF 环境暴露及遗传因素交互作用分析，以及其他IPF 易感基因的确定方面寻找更多证据，并希望最终能够从黏蛋白基因MUC5B功能及表达的研究中进一步证实遗传易感性在IPF 发病的作用。