慢病毒介导的microRNA-19b表达对鼻咽癌细胞凋亡及Wnt/β-catenin信号的影响

王申，金建平，夏兵华，常涛

（苏州市第九人民医院 耳鼻咽喉科，江苏 苏州 215200）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma,NPC）是一种起源于鼻咽部黏膜上皮的肿瘤，具有生长隐匿、不易早期诊断、较早发生淋巴结转移等特点。其发生、发展是一个多途径、多阶段、多机制积累及多遗传变异的复杂过程。抑癌基因失活、癌基因激活及其之间的互作失衡是鼻咽癌发生、发展的分子机制[1-3]。因此，寻找影响鼻咽癌发生、发展相关基因，并进一步研究其机制，对该病的诊疗具有重要意义。microRNA（miRNA）是一类非编码的小分子RNA，可控制细胞的增殖、凋亡、分化等多种生物进程，在肿瘤中充当癌基因或抑癌基因作用，并可调控下游的一些靶基因影响肿瘤的发生、发展[4]。多项研究表明，miRNAs 异常表达与鼻咽癌发生、发展密切相关[5-6]。miR-19b 是miRNAs 家族中的一员，有研究发现，鼻咽癌中miR-19b 的表达升高，与淋巴结转移、分期等有关，可能作为潜在的鼻咽癌诊断标志物[7]。鼻咽癌患者血清中miR-19b 表达水平升高。研究提示miR-19b 可能在鼻咽癌发生、发展过程中发挥重要作用[8]。有研究表明，miR-19b-3p 可通过靶向TNFAIP3/NF-κB 调控鼻咽癌放疗敏感性[9]。但目前miR-19b 对鼻咽癌细胞凋亡影响及机制尚未明确。因此，本研究旨在抑制或表达miR-19b 对鼻咽癌细胞系HONE1 增殖凋亡的影响，并进一步研究引起细胞增殖凋亡的机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年5月—2018年8月苏州市第九人民医院收治的鼻咽癌患者40 例作为研究对象，同时收集癌旁组织作为对照。所有标本经病理证实均为鳞癌。其中，男性27 例，女性13 例；年龄19～85 岁。所有患者术前均未接受放化疗及其他治疗，且均为首次确诊，研究经本院医学伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器

人永生化鼻咽上皮细胞系NP69 及鼻咽癌细胞系HONE1、5-8F 和CNE1 购自美国ATCC 公司。miR-19b 抑制表达（miR-19b inhibitor）、miR-19b 过表达和无意义序列（Scrambled）的慢病毒载体（miR-19b mimics）由上海吉玛生物制药有限公司构建。MTT 及RNA 提取试剂盒购自美国Gibco 公司，Annexin V-APC 和7-AAD细胞凋亡检测试剂及流式细胞仪购自美国BD 公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid,BCA）蛋白定量试剂盒购自美国Thermo 公司，Ki-67、p53、β-连环蛋白（β-catenin）抗体，细胞周期素D1（Cyclin D1）和C-myc购自美国Cell signal 公司，PCR 扩增仪购自美国ABI 公司，酶标仪购自美国Thermo Labsystem 公司。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养 NP69、HONE1、5-8F 和CNE1 细胞在含10% FBS 的RPMI 1640 培养基中，于体积分数5%二氧化碳CO2、95%饱和湿度的恒温培养箱中培养。

1.3.2 鼻咽癌组织及细胞中miR-19b 的表达 采用实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）。Trizol 法提取鼻咽癌细胞及组织总RNA，逆转录总RNA 为cDNA，以cDNA 为模板，使用qRT-PCR 仪进行PCR反应，PCR 的反应体系为20μl。PCR 反应体系及反应条件参照PCR 反应试剂盒说明书。以U6 作为内参基因，根据反应所得Ct 均值，采用2-△△Ct法计算miR-19b 相对于内参的表达量。

1.3.3 慢病毒转染HONE1 细胞 构建miR-19b 抑制表达（miR-19b inhibitor 组）、miR-19b 过表达（miR-19b mimics 组）和无意义序列（Scrambled 组）的慢病毒载体，并设定空白组。以最佳的MOI 值转染 HONE1细胞，慢病毒转染细胞参照慢病毒包装与使用工具手册，收集慢病毒转染细胞成功的细胞，参照1.3.2 方法检测各组细胞miR-19b mRNA 相对表达量。

1.3.4 细胞活性检测 采用MTT 法检测各组细胞活力。胰酶消化HONE1 细胞，调整细胞浓度为3×103个/ 孔，按200 μl/孔接种于96 孔板，接种24 h 后将空白组、miR-19b inhibitor 组和miR-19b mimics 组转染细胞，于转染后的24、48 和72 h 收集细胞，每孔细胞中加入MTT 溶液（5 mg/ml）20 μl，置于37℃培养6 h，弃掉上清液，每孔中加入DMSO 200 μl，轻微震荡混匀20 min，酶标仪测定570 nm 处各孔的吸光度值（A 值）。实验重复3 次。

1.3.5 细胞凋亡检测 收集生长至对数期的细胞，将细胞悬液浓度调整为6×104个/ml，铺细胞于6 孔板，置于37℃、5% CO2培养箱培养24 h 后进行转染，转染48 h 后加入干扰素-α（IFN-α）（10 000 IU/ml），72 h 后采用Annexin V-APC 和7-AAD 双染法，通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率。具体操作参照试剂盒。实验重复3 次。

1.3.6 Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和c-myc蛋白表达检测 细胞中加入裂解液提取细胞总蛋白，BCA 检测试剂盒测定蛋白浓度，每泳道取等量的蛋白样品行SDS-PAGE，电泳结束后电转移至PVDF 膜，电转好的PVDF 膜置于封闭液中2 h，洗膜，加入一抗4℃过夜，一抗Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和 C-myc均按照1∶500稀释，内参GAPDH按照1∶1 000稀释，洗膜，次日加入二抗，洗膜后常温孵育二抗（1∶2 000 稀释HRP 标记的羊抗兔）2 h，洗膜，显色液显色，暗室环境进行压片、显影、定影。

1.4 统计学方法

数据分析采用SPSS 21.0 统计软件，计量资料以均数±标准差（±s）表示，比较采用t检验或单因素方差分析或重复测量设计的方差分析，多组间进一步的两两比较采用LSD-t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-19b 在鼻咽癌组织及细胞中的表达

以癌旁组织中miR-19b 的表达及人永生化鼻咽上皮细胞系NP69 中miR-19b 的表达为1，qRT-PCR 结果显示，鼻咽癌组织miR-19b 表达为（5.13±0.52），高于癌旁组织表达（1.01±0.10）（t=48.847，P=0.000）；NP69、HONE1、5-8F 和CNE1 细胞中miR-19b 表达分别为（1.00±0.00）、（6.63±0.61）、（5.15±0.51）和（5.63± 0.50），4 组细胞miR-19b 表达水平比较，差异有统计学意义（F=83.447，P=0.000），鼻咽癌细胞中miR-19b 表达高于NP69 细胞（HONE1：t=255.188，P=0.000；5-8F：t=114.085，P=0.000；CNE1：t=259.424，P=0.000）。选取HONE1 细胞作为研究对象。见图1、2。

2.2 miR-19b 在HONE1 细胞中的表达

通过qRT-PCR 检测抑制或过表达miR-19b后HONE1 细胞miR-19b 的表达情况，与空白组（1.00±0.16）比较，Scrambled 组、miR-19b inhibitor 组、miR-19b mimics组细胞中miR-19b的表达分别为（1.03± 0.02）、（0.22±0.02）和（4.52±1.13），4 组细胞miR-19b 的表达水平差异有统计学意义（F=34.011，P=0.000）。Scrambled 组与空白组比较，差异无统计学意义（t=0.104，P=0.763），与空白组比较，miR-19b inhibitor 组miR-19b 的表达降低（t=70.200，P=0.001），miR-19b mimics 组miR-19b 的表达升高（t=28.538，P=0.006）。见图3。

图1 miR-19b 在鼻咽癌及癌旁组织中的表达（±s）

图2 miR-19b 在4 种细胞中的表达（±s）

图3 miR-19b 在各组细胞中的表达（±s）

2.3 miR-19b 对HONE1 细胞活力的影响

通过MTT 法检测各组细胞活力，空白组、miR-19b inhibitor 组和miR-19b mimics 组24 h 的OD 值分别为（0.61±0.06）、（0.56±0.06）和（0.78±0.07），48 h 的 OD 值分别为（0.80±0.09）、（0.43±0.05）和（1.34± 0.13），72 h 的OD 值分别为（0.85±0.10）、（0.31±0.04）和（1.89±0.22），3组24、48、72 h 的OD 值比较，采用重复测量设计的方差分析，结果：①不同时间点的OD 值有差异（F=255.817，P=0.004）；②3组的OD值有差异（F=164.528，P=0.006）；③3组的OD 值变化趋势有差异（F=141.676，P=0.007）。与空白组比较，miR-19b inhibitor 组在48 和72 h 细胞活力降低（t=41.656 和88.657，P=0.003 和0.001），而miR-19b mimics组在48 和72 h 细胞活力升高（t=38.009 和55.721，P=0.004 和0.001）。见图4。

2.4 miR-19b 对HONE1 细胞凋亡的影响

图4 各组不同时间的OD 值比较（±s）

采用Annexin V-APC 和7-AAD 双染法，通过流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率，空白组、miR-19b inhibitor 组和miR-19b mimics 组细胞凋亡率分别为（12.88±1.32）%、（19.17±1.45）%和（6.21±0.74）%，3组比较，差异有统计学意义（F=86.061，P=0.000）；与空白组比较，miR-19b inhibitor 组细胞凋亡率升高（t=30.870，P=0.005），miR-19b mimics 组细胞凋亡率降低（t=58.282，P=0.002）。见图5、6。

2.5 miR-19b 对HONE1 细胞Ki-67、p53、β- catenin，Cyclin D1 和C-myc 表达的影响

Western blotting 检测各组细胞中增殖相关蛋白Ki-67、凋亡相关蛋白p53 及β-catenin，Cyclin D1 和 C-myc 的蛋白表达，空白组、miR-19b inhibitor 组和miR-19b mimics 组Ki-67 蛋白表达量分别为（0.29± 0.03）、（0.12±0.02）和（0.48±0.06），p53 蛋白表达量分别为（0.13±0.02）、（0.25±0.03）和（0.05±0.01），β-catenin 蛋白表达量分别为（0.16±0.020）、（0.09± 0.01）和（0.36±0.04），Cyclin D1 蛋白表达量分别为（0.25±0.03）、（0.11±0.01）和（0.41±0.05），C-myc 蛋白表达量分别为（0.30±0.03）、（0.11±0.01）和（0.44±0.04）；3组Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1和C-myc 表达差异有统计学意义（F=59.769、88.383、53.133、70.783 和83.650，P=0.000、0.000、0.002、0.000 和0.000）；与空白组比较，miR-19b inhibitor 组Ki-67 和β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表达降低（t=59.769、76.568、63.362 和83.465，P=0.000、0.000、0.001和0.001），p53 的表达升高（t=45.522，P=0.003）；与空白组比较，miR-19b mimics 组Ki-67、β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表达升高（t=23.458、53.133、29.546 和83.450，P=0.008、0.002、0.006 和0.000），p53 的表达降低（t=47.041，P=0.002）。见图7、8。

图5 流式细胞仪检测结果显示各组的细胞凋亡情况

图6 各组的细胞凋亡率的比较（±s）

图7 各组Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和C-myc蛋白的表达（Western blotting）

图8 各组Ki-67、p53、β-catenin，Cyclin D1 和C-myc蛋白相对表达量比较（±s）

3 讨论

MicroRNA（miRNA）由22～25 个核苷酸组成，是一种内源性的单链非编码小分子RNA，在肿瘤中可能是一类潜在的癌基因或抑癌基因，可通过与靶基因的配对结合而调控靶基因表达[10]。目前已有大量研究证实，miRNAs 表达及功能失调影响肿瘤发生、发展[11-12]。有研究显示，miR-143 能够抑制鼻咽癌细胞CNE-2Z 的增殖、迁移和侵袭能力[13]。miR-324-3p可能通过诱导EMT 改变调控鼻咽癌细胞的侵袭转移能力[14]。提示miRNAs 可能对鼻咽癌的诊断、治疗及预后评价有重要意义。miR-19b 是miRNAs 家族中的一员，可影响多种肿瘤的生物学过程[15]，在鼻咽癌中表达升高，但对其生物学特性研究还未清楚。

本研究中抑制或过表达miR-19b 的慢病毒转染EBV 阴性鼻咽癌细胞系HONE1，获得稳定的慢病毒转染细胞细胞后，通过MTT 法检测细胞活力，流式细胞仪检测其对IFN-α诱导的细胞凋亡的影响，结果显示，抑制miR-19b 表达的鼻咽癌细胞活力降低，凋亡率增加，而过表达miR-19b 的鼻咽癌细胞活力升高，凋亡率降低。提示miR-19b 对鼻咽癌发生、发展的影响。Ki-67 是一个可标记细胞增殖状态的抗原，与多种肿瘤的增殖有密切关系，能可靠和全面地反映细胞的增殖状态，目前已在细胞增殖研究中有广泛应用[15]。Ki-67在鼻咽癌中的研究相对较少，但有研究发现其可影响鼻咽癌细胞增殖，且可作为鼻咽癌预后判断的一个独立指标[16]。p53是一个重要的抑癌基因，有启动细胞凋亡、阻滞细胞周期等作用，其失活是多种肿瘤发生、发展的一个重要事件[17]。鼻咽癌中p53 的活化可诱导癌细胞的凋亡[18]。为检测miR-19b 引起鼻咽癌增殖凋亡的机制，本研究进一步检测miR-19b 对Ki-67和p53 表达的影响。结果显示，抑制miR-19b 表达可下调Ki-67 表达，上调p53 表达，而过表达miR-19b可上调Ki-67 表达，下调p53 表达。提示miR-19b 可通过调节Ki-67 和p53 表达影响鼻咽癌增殖和凋亡。Wnt/β-catenin 信号通路是细胞内一条重要的信号途径，参与细胞增殖、凋亡、分化等过程的调控，与多种肿瘤的发生密切相关，且在多种肿瘤中出现异常激活[19-20]。抑制Wnt/β-catenin 信号通路可降低鼻咽癌细胞生长[21-22]。本研究检测各组细胞中Wnt/β-catenin信号通路关键分子β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 的表达，结果显示，抑制鼻咽癌中miR-19b 的表达可下调β-catenin、Cyclin D1 和c-myc 的表达，而过表达miR-19b 可上调β-catenin、Cyclin D1 和C-myc 表达。提示miR-19b 可通过下调Wnt/β-catenin 信号通路降低鼻咽癌的发生、发展。

综上所述，抑制miR-19b 表达载体转染鼻咽癌HONE1 细胞可降低细胞活力，诱导细胞凋亡及下调Wnt/β-catenin 信号通路，降低细胞活力方式是下调Ki-67 表达，诱导细胞凋亡方式是上调p53 表达，而转染过表达miR-19b 载体反之。本研究提示miR-19b可能是鼻咽癌诊疗的一个有效的分子靶点。