基于ISSR的野生和栽培的褐苞薯蓣遗传多样性分析＊

曾昭清，高慧新，朱 华，田 慧

（1. 广西中医药大学药学院 南宁 530002）

褐苞薯蓣（Dioscorea persimilis Prain et Burkill），药材名为广山药，为薯蓣科薯蓣属植物，别名广西壮族自治区（以下简称“广西”）淮山，淮山药，山板薯，分布在海拔100-1950 m 的山坡、路旁、山谷杂木林或灌丛中。我国南方各地有栽培，主产于广西陆川、玉林、桂平、平南、灵山[1]。褐苞薯蓣是广西的道地药材，根茎入药，其性味甘、平，具有“补脾养胃，生津益肺，补肾涩精”的功效，用于脾虚食少，久泻，脾虚咳喘，肾虚遗精，带下，尿频，虚热消渴等症。此外，该药也被《广西壮族自治区壮药质量标准》收载，其性味甜、平，具有“调谷道气道水道，补肺肾”的功效，用于埃病（咳嗽），啊肉甜（消渴）等症[2]。

ISSR（inter-simple sequence repeat）即简单重复序列，具有多态性高、重复高、稳定性好、操作方便及成本低等优点[3，4]。近年来ISSR 分子标记技术被广泛应用于品种鉴定和亲缘关系分析、系统发育遗传多样性的分析和与目标基因连锁的ISSR 标记辅助育种等方面。张盾等[5]在对野生山莨菪遗传多样性进行研究，采用ISSR 分子标记法，研究结果表明：野生山莨菪居群之间具有较高的遗传多样性，各居群间遗传距离与地理距离显著相关。中药的野生品与栽培品之间质量多有不同，对临床疗效有影响。王飞等[6]比较分析了栽培山药和野生山药的营养品质，研究表明栽培山药营养品质优于野生山药，而关于野生和栽培褐苞薯蓣遗传多样性分析尚未见报道。因此，本研究采用ISSR分子标记法分析野生和栽培广山药遗传多样性，研究结果将为广山药亲缘关系和品种选育提供科学依据。

表1 用于ISSR分析的褐苞薯蓣的样品

1 实验材料

1.1 实验样品的采集

本实验采集褐苞薯蓣地上部分，分别来自广西南宁、桂林、贵港、柳州、钦州、玉林、百色、梧州、贺州、防城港、河池、来宾、湖南永州、广东韶关，摘取其新鲜叶片作为供试材料，立刻装入含硅胶的密封袋中，并勤换硅胶，直至样品干燥完全。所采集的样品经广西中医药大学药用植物教研室梁子宁教授鉴定为：薯蓣科薯蓣属褐苞薯蓣。样品保存于广西中医药大学壮瑶药协同创新中心样品储存室-20℃冰箱，备用。样品采集信息见表1。

1.2 ISSR引物合成与处理

本实验所用150 条引物，其中100 条来自哥伦比亚大学（UBC）公布的通用引物，其余50 条为自设引物，自设引物遵循ISSR 引物设计原则：2-3 个碱基简单重复4-5 次，一端或者两端加2-4 个锚定碱基。引物均由华大基因公司合成。引物合成后，按要求对引物进行处理：将引物管离心数秒，使DNA 聚集到管底，小心开启管盖，以免引起粉末飞扬丢失。按说明书加入适量ddH2O或TE缓冲液将其稀释成10 μM 的浓度，分装置-20℃保存备用。

2 实验仪器与试剂

2.1 实验仪器

自动高压灭菌锅（Panasonic MLS-3781L），电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒DHG-9240A），手掌型离心机（大龙D1008），高速冷冻离心机（德国赛默飞），梯度PCR 仪（Bio-Rad T100），电泳仪（Bio-Rad），凝胶成像仪（Bio-Rad），超纯水一体机（Merck Millipore Direct-Q 5UV），涡旋振荡仪（上海滬西XW-80A），水浴锅(上海天恒HWS-24)

2.2 实验试剂

DNA 提取试剂盒、RNase 酶、D2000 DNA Marker（天根生化科技有限公司），GelRed 染料（美国Biotium公司），琼脂糖（美国英杰生命技术有限公司）

3 实验方法

3.1 叶片基因组DNA提取

对所有样品进行总DNA 的提取，方法按照植物总DNA 提取试剂盒（天根生化科技有限公司）操作步骤，将提取的总DNA分装至-20℃保存备用。

3.2 引物的筛选

用104份褐苞薯蓣样品对150条ISSR 引物进行扩增筛选，所有的PCR 产物经1.2%琼脂糖凝胶（含GelRed 核酸染料）检测，筛选出条带多、清晰、多态性好的引物用于本次实验。

3.3 PCR扩增

ISSR-PCR 反应体系设置为：PCR 反应体系的体积为20 μL，2 × Taq PCR Mastermix 10 μL，引物1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 8 μL。ISSR-PCR 扩增程序为：95℃预变性5 min，95℃变性40 s，退火45 s（不同引物Tm值决定），72℃延伸2 min，34个循环，72℃延伸5 min，4℃保存[7]。

3.4 电泳检测

取7 μL PCR 产物置于1.2%的琼脂糖凝胶（含GelRed 染料）中进行电泳，电压60 V，电泳80 min，用D2000 DNA Marker 作为标准参照。电泳结束后，在紫外凝胶成像仪中观察并拍照保存。

3.5 数据统计和分析

3.5.1 扩增条带的统计与矩阵图的建立

ISSR 为显性标记，同一引物扩增产物中电泳迁移率一致的条带被认为是同一位点的产物[8]。对凝胶电泳图进行分析，同一位点有相同的扩增条带记为“1”，无则记为“0”，从而得到“1”和“0”的矩阵图[9]。

表2 ISSR扩增中使用的引物

3.5.2 分析软件对数据的处理

采用 POPGENE1.32、NTSYS2.10 软件对 SSR-PCR数据进行归类和分析。利用POPGENE1.32计算出：等位基因数（Number of alleles，Na）、有效等位基因（Number of effective alleles，Ne）、Shannon's 信息指数（I）、Nei's 基因多样性指数（h）等遗传多样性参数，居群内基因多样性（Hs）、居群总基因多样度（Ht）、居群间遗传分化系数（Gst）以及基因流（Nm）等遗传分化指标，然后利用NTSYS2.10软件做聚类分析图。

4 结果

4.1 引物的筛选

本实验从150 条引物中筛选出9 条重复性好、条带清晰且多态性高的引物，其中包含通用引物7条，自设引物2 条（自设引物序列在此因保密要求不做公开），可用于遗传多样性分析。引物序列见表2。

表3 褐苞薯蓣居群ISSR选择性扩增引物产生的多态性条带

4.2 遗传多样性分析

4.2.1 引物扩增结果

采用筛选出的9 条引物的最佳退火温度对104 份褐苞薯蓣总DNA 进行扩增，共扩增出条带106 条（图1、表3），其中多态性条带104 条，多态性百分比（PPB）为98.11%。其中引物多态性百分比最高达100%，引物多态性百分比最低为88.89%。

4.2.2 不同居群的样品遗传多样性分析

本实验采用POPGENE1.32 软件对不同居群的褐苞薯蓣样品进行遗传多样性分析（表4），居群名称后“1”代表栽培样品居群，“2”代表野生样品居群。通过等位基因数（Na）、有效等位基因（Ne）、Nei's 基因多样性指数（H）和Shannon's 信息指数（I）这几个参数来反映供试样品的遗传多样性。由整体样本的物种水平可知，褐苞薯蓣的 Na 值为 1.9811，Ne 值为 1.6357，H 值为0.3675，I 值为0.5439，说明供试褐苞薯蓣样品整体遗传多样性水平较高；野生样品居群的Na值、Ne值、H值、I 值平均为 1.5006、1.3847、0.2108、0.3039，栽培样品 居 群 的 Na 值 、Ne 值 、H 值 、I 值 平 均 为 1.4163、1.3080、0.1698、0.2469，两者比较来看，供试褐苞薯蓣野生居群样品比栽培居群样品具有更高的遗传多样性。

表4 褐苞薯蓣居群间的遗传多样性指数

图1 引物UBC823的PCR扩增电泳图（图中样品编号分别对应表1中各样品）

表5 褐苞薯蓣居群间遗传分化系数及基因流

4.2.3 遗传分化的分析

本实验采用POPGENE1.32 软件对不同居群苞薯蓣样品进行遗传分化分析，结果见表5，来自不同居群褐苞薯蓣居群总基因多样度（Ht）为0.3527，居群内基因多样性（Hs）为0.1892，居群间遗传分化系数（Gst）为0.4636。其中Gst＞Hs，说明褐苞薯蓣居群间遗传分化度比居群内遗传分化度更高。基因流（Nm）为0.5785 ＜1，说明褐苞薯蓣居群间遗传分化水平较低，不同居群间基因交流较少。

4.2.4 遗传距离的分析

采用POPGENE1.32 软件对不同居群褐苞薯蓣的遗传距离进行分析，褐苞薯蓣的Nei's 遗传相似度和Nei's遗传距离见表6。不同居群的褐苞薯蓣遗传相似度在0.7105-0.9107 范围内，遗传距离在0.0936-0.3418范围内，说明不同居群的遗传相似度较高，遗传距离较近；其中，湖南永州和广东韶关样品的遗传相似度为0.9107，遗传相似度最高；钦州和贺州样品的遗传相似度为0.7105，遗传相似度最低。湖南永州和广东韶关的遗传距离为0.0936，遗传距离最小；钦州和贺州样品的遗传距离为0.3418，遗传距离最大。

4.2.5 不同居群样品的NTSYS聚类分析

采用NTSYS2.10软件对不同居群褐苞薯蓣进行聚类分析，聚类图见图2。遗传相似度在0.78，可将褐苞薯蓣分成两大类，第1类包括12个居群的样品，第2类包括4个居群的样品。

遗传相似度在0.82 时，可将第1 类分为3 个亚类，第1 亚类为南宁居群的栽培和野生样品；第2 亚类为桂林、柳州、百色、河池、贺州居群的野生样品；第3 亚类为桂林、贵港、梧州、贺州的栽培居群样品。遗传相似度在 0.82 时，可将第 2 类分为 2 个亚类，第 1 亚类为钦州和玉林居群的栽培样品；第2 亚类为湖南永州居群的栽培样品和广东韶关居群的野生样品。

由上可知，大部分的野生样品居群聚在一起，大部分的栽培样品也是聚在一起的，表明供试褐苞薯蓣的野生样品和栽培样品是存在差异的；南宁居群的野生和栽培样品聚为一类，表明南宁居群的栽培样品为就近移栽；相近居群的野生样品和栽培样品分别聚在一起，表明大部分样品的遗传距离与地理位置有关。

表6 不同褐苞薯蓣居群遗传相似度（左上角）与遗传距离（右上角）

图2 不同褐苞薯蓣居群聚类图，居群名称参见表1

5 讨论

褐苞薯蓣作为一种很有发展前景的药食两用的植物，已受到人们广泛关注，民间有崇尚食用野生广山药进补的传统，市场上大宗商品多为栽培品[10]。已有一些研究表明，褐苞薯蓣褐可以作为山药长期药用及食用且具有一定的科学根据[11，12]。如今，ISSR 分子标记技术已广泛被应用于野生与栽培品种鉴定，蒋雨晗等[13]在对白芍亲缘关系进行研究，ISSR 分子标记技术能有效检测栽培白芍遗传多样性，揭示白芍遗传背景以及栽培白芍遗传距离的大小和亲缘关系的远近。孙稚颖等[14]采用ISSR 标记对金银花种质资源遗传多样性进行分析，研究显示ISSR标记可以很好为金银花的种质资源鉴定、遗传关系分析及栽培育种提供分子生物学依据。有学者[15-19]采用ISSR技术对中药的野生品与栽培品进行了比较，研究结果均显示该分子标记在遗传多样性方面能区分野生品和栽培品。

本研究采用ISSR 技术对不同居群褐苞薯蓣进行遗传分析，筛选出9 条扩增效果较好的引物用于此次实验，扩增多态性条带104 条，多态性百分比（PPB）为98.11%，有效等位基因（Ne）为1.6305，Nei's 基因多样性指数（H）为 0.3653 和 Shannon's 信息指数（I）为0.5413，以上结果均表明ISSR 分子标记方法适用于褐苞薯蓣的遗传多样性分析，本次实验所采样本在褐苞薯蓣DNA 水平上具有较高的遗传多样性水平；野生样品居群的 Na 值、Ne 值、H 值、I 值均高于栽培样品居群，表明褐苞薯蓣野生居群样品比栽培居群样品具有更高的遗传多样性；聚类结果表明褐苞薯蓣遗传距离与地理距离具有一定的相关性，样品所在地理位置和气候特点愈相似，样品间的生物遗传信息愈相近；同时野生品和栽培品之间存在遗传差异。

本研究利用ISSR 分子标记技术从基因组水平揭示了不同居群褐苞薯蓣种质资源的遗传差异及亲缘关系，进而分析其遗传多样性，有助于褐苞薯蓣种质资源的利用、发展与保护。