基于网络药理学的佛手干预2型糖尿病潜在靶点机制研究＊

张 磊 ，朴胜华 ＊＊，郭 姣

（1. 广东药科大学广东省代谢病中西医结合研究中心 广州 510006；2. 广东药科大学广东省代谢性疾病中医药防治重点实验室 广州 510006）

2 型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）是临床常见的重大慢性疾病之一，其发病机制复杂，目前研究表明主要与氧化应激、慢性炎症及胰岛素抵抗等有关[1-3]。根据国际糖尿病联盟（International Diabetes Federation，IDF，https://diabetesatlas.org/en/）于 2017 年发布数据显示，全球约有4.25 亿糖尿病成人患者，截至2017 年底，中国国内共有约1.144 亿糖尿病患者（20-79 岁），而患病人群以T2DM 为主，占比约93.7%[4]。中医药因其多成分多靶点作用，在治疗这种病机复杂的T2DM 等代谢性疾病上具有一定的优势。团队带头人郭姣教授首次整体认识该类疾病，提出瘅浊（糖脂代谢病）新理论[5]，依据其“肝失疏泄，五脏六腑皆受其制，湿痰瘀浊内阻”的核心病机，创建“调肝启枢化浊”法取得显著效果，贞术调脂方为该法的代表方药，佛手作为君药在其中发挥了重要作用[6-8]。

佛手，别名广佛手、佛手果、佛手柑，为芸香科植物佛手的果实，味辛、苦、酸，温，归肝、脾、胃、肺经，一味药兼有疏肝理气，燥湿化痰的功效。其主要化学成分包含多种生理活性物质，如挥发油类、黄酮类、香豆素类、多糖、氨基酸和无机盐等[9]，多项研究显示了较好的降低血糖[10]、调节血脂[11]、改善胰岛素抵抗[12]等调节糖脂代谢紊乱的作用。Meta 分析临床运用佛手治疗T2DM 疗效显著[13]，临床试验[14-16]表明佛手提取物有降血脂和降血糖作用、可调节胰岛素敏感性、改善脂质和葡萄糖代谢，但对其干预T2DM 的靶点机制缺乏整体系统研究。

近年来，基于网络药理学方法的中医药治疗T2DM 相关研究层出不穷，李梢[17，18]最早提出生物网络与中药方剂研究，为中医网络药理学方法论及中医药现代化研究奠定基础。网络药理学具有整体性和多向性，通过分子网络信息挖掘、数据筛选和网络构建等方式，系统阐述药物的药理作用及机制。本文与中医药治疗T2DM 研究[19，20]运用数据挖掘方法类似、治疗靶点也多有一致性[21]，说明运用网络药理学研究中医药疗效方法可靠、结果准确，可为进一步研究提供思路。基于此，本研究拟应用网络药理学，预测佛手干预T2DM 的潜在作用靶点及药物作用机制，为开发针对性药物及临床应用提供新的思路和方向。

1 材料与方法

1.1 疾病靶点预测

通过药物作用靶点数据库（Therapeutic Target Database，TTD，https://db.idrblab.org/ttd/）、Drugbank 数据 库（https://www.drugbank.ca/）、OMIM（http://www.omim.org/）和 DisGeNET 数据库（http://www.disgenet.org/web/DisGeNET/menu/home）检索 T2DM 英文名，得到T2DM 相关基因，并将靶点基因导入Uniport 数据库（http://www.uniprot.org/）进行基因标准化，删除重复及无法标准化靶点基因后整合汇总，作为疾病的候选靶点基因。

1.2 药效成分虚拟筛选

基于药代动力学参数吸收、分布、代谢、排泄（absorption、distribution、metabolism、excretion，ADME），在中药系统药理学数据库与分析平台数据库（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）以“佛手”为关键词，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥ 30%、类药性（drug likeness，DL）≥0.14为条件进行检索，将得到的化学成分，作为佛手的候选药效成分。

1.3 药效成分靶点预测

将筛选出的候选药效成分导入PubChem 数据库（https://PubChem.ncbi.nlm.nih.gov/）查 询 各 成 分 的SMILE结构，或通过ALOGPS 2.1（http://www.vcclab.org/lab/alogps/）计算其SMILE结构，将SMILE结构导入Swiss Target Prediction 数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测候选药效成分的作用靶点，并将得到的作用靶点导入Uniport数据库进行基因标准化。

1.4 网络构建和分析

基于疾病靶点预测、佛手药效成分筛选和成分靶点预测，得到疾病靶点关系及药效成分-靶点关系，导入该数据并通过Cytoscape 3.7.1 软件功能设置，构建出3 个网络，分别是：疾病-靶点关系网络，药效成分-靶点关系网络，疾病-药效成分-靶点关系网络。再利用软件中的“NetworkAnalyzer”功能对自由度（degree）等网络拓扑参数进行统计分析。将预测出佛手干预T2DM 的靶点导入 STRING 数据库（https://string-db.org/），得到佛手干预T2DM的靶点相互作用关系。

1.5 药效成分-靶点分子对接

从 RSCB PDB 数据库（https://www.rcsb.org/）下载靶蛋白的3D 结构pdb 格式文件，运用Auto Dock 软件移除靶蛋白中的配体和非蛋白分子（如水分子），保存为pdbqt 格式文件。从PubChem 数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下载化合物 2D 结构的 mol2 格式文件，利用PyRx 软件上传化合物文件使其能量最小化，并将其转化为pdbqt 格式文件，最后运用Vina 进行对接。一般认为配体与受体结合的构象稳定时能量越低，发生作用的可能性越大。结合能≤0 kJ·mol-1说明配体与受体可以自发结合，本研究以结合能≤-5.0 kJ·mol-1为筛选条件。

1.6 生物学功能和通路分析

将佛手和T2DM 共同靶点导入DAVID 6.8 数据库（https://david. ncifcrf. gov/），物 种 选 择 人 类（homo sapiens，human），进行基因本体论（gene ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）分析。利用imageGP 工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）绘制“佛手干预T2DM的生物学过程分析”图、“佛手干预T2DM的分子功能分析”图。

2 结果

2.1 疾病靶点预测结果

分别利用 TTD（56 个）、Drugbank（157 个）、OMIM（73 个）和 DisGeNET（2 个）等 4 个数据库进行检索T2DM，共得到181 个相关基因，作为疾病候选靶点基因（图1）。

2.2 药效成分虚拟筛选结果

通过筛选，共得到7 种候选药效成分，包括固醇类、黄酮类及油酸等（表1）。

2.3 药效成分靶点预测结果

通过PubChem 数据库进行查询，或将其二维结构导入ALOGPS 2.1计算得到各成分的SMILE结构，通过Swiss Target Prediction 数据库预测出成分的作用靶点，并导入Uniport数据库进行基因标准化。共得到成分-靶点关系65对。

2.4 网络构建与分析结果

2.4.1 疾病靶点关系网络构建

在STRING数据库导入T2DM相关靶点基因，通过其功能插件获得靶点基因关系，再利用Cytoscape 3.7.1软件，构建疾病靶点关系网络（图2）。网络显示：181个节点，2915条边，分析网络平均邻节点数结果为32.210。

2.4.2 药效成分-靶点关系网络构建

在Cytoscape 3.7.1 软件中导入筛选出的药效成分-靶点关系，构建药效成分-靶点关系网络。网络显示：72 个节点（7 个药效成分节点、65 个成分相关靶点基因节点），65 条边，分析网络平均邻节点数结果为1.806。

2.4.3 疾病-药效成分-靶点-通路关系网络

（1）佛手干预T2DM 的靶点及靶点间相互作用关系

Cytoscape 3.7.1软件中的“Merge”功能可合并分析网络，利用该功能将疾病靶点关系网络与药效成分-靶点关系网络合并，得到佛手干预T2DM 的预测靶点，将该结果导入COXPRESdb 数据库（https://coxpresdb.jp/）进行基因共表达的网络拓展，通过STRING 构建预测靶点相互作用关系图（图3），以Score ≥0.9 为条件，共筛选出25 个基因（表2），作为佛手干预T2DM 预测靶点的最终结果。

（2）疾病-药效成分-靶点-信号通路关系网络构建

在Cytoscape 3.7.1 软件中导入疾病-药效成分-靶点关系，得到疾病-药效成分-靶点关系网络。

图1 疾病靶点维恩图

表1 佛手候选药效成分筛选结果表

将25 个关键靶点导入DAVID 6.8 数据库，物种选择Homo sapiens（Human），得到10 条KEGG 通路，包括3 条信号通路（PPAR 通路、NOD 样受体通路、TNF 通路）。在Cytoscape 3.7.1 软件中导入靶点-通路关系，得到靶点-通路关系网络。

基于疾病-药效成分-靶点关系网络与靶点-通路关系网络，利用“Merge”功能合并网络，最终得到疾病-药效成分-靶点-通路PPI 网络（图4）。网络显示：42 个节点（1 个佛手节点、6 个佛手药效成分节点、25个T2DM 疾病靶点节点、10 个通路节点），91 条边，分析网络平均邻节点数结果为4.333。

2.4.4 药效成分-靶点分子对接

选取10 个（S1-S10）关键蛋白与6 个佛手药效成分，利用Vina进行分子对接。以结合能≤-5.0 kJ·mol-1为筛选条件，结果（表3）显示，蛋白SQLE、CYP51A1、IDI1、PTPN1、CXCL8 与化合物 Sitosterol alpha1 结合能最低，分别为-7.2 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1、-7.0 kJ·mol-1、-8.1 kJ·mol-1、-9.3 kJ·mol-1，而蛋白HMGCR、HMGCS1、MSMO1、NCOA3、PTGS2 则与化合物5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone 结合能最低，分别为-7.5 kJ·mol-1、-7.4 kJ·mol-1、-8.5 kJ·mol-1、-8.1 kJ·mol-1、-9.0 kJ·mol-1。由分子对接结果可见，佛手的6种有效化学成分与T2DM关键蛋白形成构象能量低、结构稳定、结合活性较高。

图3 佛手和T2DM共同靶点间相互作用关系图

表2 佛手干预T2DM的靶点预测结果

图4 疾病-药效成分-靶点-通路关系网络

表3 药效成分-靶点分子对接结果

2.4.5 结合模式分析

根据“2.4.4”项分子对接结果，对表3 中结合最低（潜在活性最高）的PTGS2（PDB ID：5IKR）与5,2',6'-Trihydroxy-7, 8-dimethoxyflavone、CXCL8（PDB ID：4XDX）与Sitosterol alpha1 的分子对接模型进行分析（图5）。3D 结合模式显示，5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone结合于蛋白PTGS2的α螺旋结构域和β折叠结构域交界处的柔性loop 区靠近N 端区域，Sitosterol alpha1则结合于蛋白CXCL8的柔性loop区中心区域。

2D 结合模式显示，5, 2', 6'-Trihydroxy-7, 8-dimethoxyflavone 与蛋白PTGS2 结合时，配体羟基可与His39B、Tyr130B、Ayg44B、Cys47B形成氢键作用（图中虚线为氢键），在Pro153B、Cys36B、Leu152B 处有疏水作用力和范德华力。Sitosterol alpha1 与蛋白CXCL8结合时，配体羟基可与Lys3A 形成氢键作用，在Arg26A处有疏水作用力和范德华力。

2.5 生物学功能和通路分析结果

2.5.1 生物学功能分析

（1）GO分析结果

图5 PTGS2与5,2',6'-Trihydroxy-7,8-dimethoxyflavone和CXCL8与Sitosterol alpha1的对接模式

图6 佛手干预T2DM的生物学过程分析（P ≤0.05）

图7 佛手干预T2DM的分子功能分析（P ≤0.05）

将佛手和T2DM 靶点的25 个共同靶点导入DAVID 6.8数据库，物种选择为Homo sapiens（Human），筛选条件为P≤ 0.05，进行GO 功能富集和KEGG 通路富集分析，共确定了57 个GO 条目。其中有43 条关于生物过程的条目，主要有胆固醇生物合成过程、对脂多糖的反应、类异戊二烯生物合成过程、葡萄糖稳态调节、RNA 聚合酶II 启动子的转录起始、血压负调节、胰岛素分泌的正调节、脂质代谢过程、甘油三酯吸收负调节、胆固醇贮存负调节、脂多糖的细胞反应及脂肪酸转运等方面；10 条关于分子功能的条目，包括药物结合、脂质结合、蛋白磷酸酶2A结合、脂肪酸结合、NADP结合、类固醇激素受体活性及趋化因子活性等方面。

（2）GO分析结果绘图

用 imageGP 工具（http://www.ehbio.com/ImageGP/）绘制“佛手干预T2DM涉及的生物学过程分析”（图6）、“佛手干预T2DM涉及的分子功能分析”（图7）。

2.5.2 KEGG分析

将佛手和T2DM 靶点的25 个共同靶点导入DAVID 6.8 数据库，物种选择 Homo sapiens（Human），得到10条KEGG通路。显示佛手干预T2DM可能是参与了 PPAR 信号通路、TNF 信号通路的调控、NOD 样受体信号通路、类固醇生物合成及代谢通路等过程，利用imageGP工具绘制“佛手干预T2DM通路”（图8）。

图8 佛手干预T2DM通路（P ≤0.05）

3 讨论

T2DM 的发病机制尚不明确，目前大多考虑与胰岛素抵抗[1]、炎症细胞因子[3]、及DNA 甲基化[22]等方面相关。现有的治疗药物多是通过改善肝腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）信号通路[23]、调节胰高血糖素样肽-1（GLP-1）生成[24]、抑制钠-葡萄糖协同转运蛋白 2（SGLT-2）表达[25]及改善胰岛β细胞分泌功能[26]等方面治疗T2DM。

本研究发现，佛手可通过谷甾醇α甾醇、黄酮类（甲氧基黄酮）、角鲨烯等6 个有效成分干预T2DM 的25 个靶点基因和10 条相关通路发挥作用，其中的靶点基因主要有MSMO1、PTPN1、NCOA3、PTGS2、NOS2、FABP4、RBP4、FFAR1、CXCL 家族及 PPAR 家族等，上述基因功能主要与调节胰岛素信号通路、体内炎症状态、胰岛素分泌、脂质代谢等密切相关。其中MSMO1 基因的位点既与调节体内血糖水平相关[27]，又与高密度脂蛋白胆固醇相关[28]；PTPN1 基因参与胰岛素信号通路的传导调控[29]，且中国女性人群中，PTPN1 启动子甲基化升高是T2DM 的危险因素[30]；NCOA3 基因（即SRC-3）通过减少PGC-1 的乙酰化作用防止肥胖并提高胰岛素敏感性[31]；PTGS2（COX-2）与胰岛素分泌有关[32]；NOS2 可促进 COX2（PTGS2）的激活[33]，也可作用于NO 生成，导致内皮功能障碍，最终影响T2DM；FABP4 也称为A-FABP，可调节胰岛素敏感性，并参与炎症与胰岛素信号传导[34]；IRS1-Ras-MAPK 通路是胰岛素受体的信号传导通路，RBP4 可通过调节该通路，影响T2DM 的胰岛素抵抗[35]；通过干预胰岛β细胞，FFAR1 可调节胰岛素分泌[36]；CXCL家族与糖尿病和高脂血症发生发展相关[37]。在糖尿病发病中，PPAR 信号通路是重要调节通路之一，PPARs 是核转录因子超家族成员，通过配体激活的方式在T2DM 及肥胖病程进展中起重要作用，被认为是代谢综合征治疗中最有前景的靶标之一[38]。PPAR 家族与糖脂代谢及胰岛素抵抗密切相关[39，40]。说明佛手干预T2DM 是通过多成分、多靶点、多通路共同作用的结果。

此外，研究中还发现，佛手的有效成分可以同时作用于HMGCR、HMGCS1、CYP51A1、IDI1 及 SQLE 等靶点参与胆固醇生物合成、脂质合成和脂蛋白代谢等过程[41-45]，说明佛手具有潜在的调脂作用，这些靶点则是佛手发挥调脂作用的潜在靶点。

基于此，兼具疏肝理气与燥湿化痰功效的佛手，可以同时作用于具有调节糖、脂代谢的靶点和通路，为其临床应用于糖脂代谢紊乱合并或并病的患者提供了依据，同时说明中药治疗慢性、代谢性、复杂性疾病具有极大的研究潜力和价值。