广西壮族自治区南宁市新生儿GJB2致聋基因的携带研究

黄卫彤，朱茂灵，覃卫娟，王宗杰，廖 旺，曾贵祥

(南宁市妇幼保健院，南宁 530011)

目前国内外报道耳聋基因GJB2突变引发儿童非综合性耳聋概率较高[1]，主要以极重度和重度听力损失为主。我国人群中GJB2基因最常见的致病突变位点为c.235del C，c.299-300 del AT，c.176-191 del l6和c.35 del G[2]，随着耳聋基因检测技术的发展，近年又相继发现 GJB2 35 del G，176 del 16，235 del C和299 del AT等新的致病突变位点，而且文献报道[3-4]基因突变位点有地域差别。目前尚未见南宁市针对新生儿进行GJB2全基因测序的研究报道,本研究旨在探讨南宁市新生儿GJB2致聋基因的突变特点，了解基因携带率，筛查出与耳聋相关的基因突变位点，为制定适于南宁市新生儿耳聋基因筛查方案提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2016年1月～2018年12月南宁市新生儿疾病筛查中心1 007例听力初筛未通过的新生儿为研究对象，经知情同意和通过广西全民健康信息平台查看新生儿基本信息、听力初筛、听力损失确诊等资料并跟踪随访GJB基因突变者耳聋情况。听力损失确诊方法：听性脑干反应(ABR)和畸变产物耳声发射(DPOAE)及声导抗检查。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂盒:DNA提取试剂为北京天根生化科技有限公司，测序试剂为TAKARA Multiplex PCR Assay Kit ver.2(宝日生物技术工程有限公司) 。

1.2.2 主要仪器：基因扩增仪(ABI 2720),荧光定量PCR仪(ABI 7500)，测序仪(Miniseq)。

1.3 方法

1.3.1 标本采集：由护士采集新生儿静脉血或足跟血，分别制成直径8mm的3个血斑滤纸干血片并晾干，保存于-20℃冰箱，留待检测。

1.3.2 DNA提取方法：用血片打孔器将血斑打孔得到6mm直径的干血斑，经萃取后，用全血基因组DNA提取试剂提取DNA，用核酸浓度检测仪检测DNA浓度，其最低工作浓度应≥5ng/μl。

1.3.3 GJB2基因测序方法：①文库构建： PCR扩增。② 文库纯化。③文库质检：参照KAPA Library Quantification Kit Illumina platforms TDS对文库进行定量。④测序：将文库pooling,变性最终以1.8 pmol/L的文库上机测序。⑤数据分析方法：采用fastQC对测序数据进行质量评估，移除接头污染以及平均质量值低于20测序数据，对于总数据量低于1.2 mol/L的样品或者平均测序深度低100×的样品予以重新测序。运用bwa软件的mem 模型将测序数据与人数参考基因组(hg19)进行比对后，通过Picard和GATK等软件对样品的SNV和indel进行检测，检出的基因突变采用snpEff软件进行基因注释和功能,通过SnpSift软件和dbNSFP3数据库对突变进行功能预测。⑥生物信息学分析：利用GATK工具判读SNP和Indel位点；利用Snpeff工具注释SNP，最后利用dbSNP、千人基因组数据库、HGMD等数据库、clinvar数据库进行注释和比较分析。

1.4 统计学分析 所有数据采用SPSS 19.0统计软件进行分析，GJB2基因携带率以百分率(%)表示，基因突变位点差异性比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。待测序的GJB2突变位点类型分为已明确的致聋位点、未明确致聋位点(包括新基因位点)及多态性位点三种类型。

2 结果

GJB2各突变位点、携带率及GJB2c.109 G>A携带率与其它城市比较结果分别详见表1，表2。 1 007例新生儿中GJB2致聋基因携带率为55.21%(556/1 007)，共检测出GJB2突变位点16个，其中GJB2 c.109 G>A 突变携带率较高，占20.36%，其次是c.79 G>A 占10.03%，c.608 T>C 占7.65%，c.217 C>A 占7.15%，c.341 A>G 占6.85%，其它位点(包括c.11 G>A ，-23+1 G>A， c.235del C， c.299 del AT，c.-121 G>A ，c.464 A>G，c.147 C>G， c.676 G>T ，c.316 T>G ，c.-23-35 G>T和c.368 C>A)突变携带率<0.1%。通过广西全民健康信息平台查看556例GJB2携带者基本信息、听力初筛、听力损失确诊资料和跟踪随访结果，有31例确诊听力损失(不同程度耳聋)，基因突变致聋率为5.58%。其中检出GJB2致聋突变位点包括 c.109 G>A(纯合子突变)，c.235del C(纯合子突变)， c.299 del AT(纯合子突变)和c.11 G>Ac(杂合子突变)，分别占耳聋率的83.87%，6.45%，3.23%和6.45%。81例听力确诊正常者检出6个新突变位点，包括c.-23-35 G>T ，c.-121 G>A ，c.464 A>G， c.217 C>A，c.147 C>G和c.676 G>T。4例检出1个未明确致病性位点是c.-23+1 G>A 。250例确诊听力正常者携带其它5个突变位点为中国人群最常见多态突变位点。GJB2 c.109 G>A携带率与北京[5]、台湾[6]和上海[7]比较，差异均有统计学意义(χ2=133.364,11.724,32.449,均P<0.05)，与广东[8]比较差异无统计学意义(χ2=0.085，P>0.5)。

3 讨论

3.1 研究结果显示 南宁市新生儿GJB2携带率高达55.21%，基因突变致聋率为5.58%，致聋率与国内报道基本一致[2]。筛查出4个致聋突变位点中，c.109 G>A携带率最高，与北京、上海等城市比较有地域性差别。GJB2 c.109 G>A纯合子突变者均确诊为不同程度耳聋，占致聋突变位点的83.87%，与国内外戴翔等报道比较偏高[4，9]，其次是c.235 delC，c.299 del AT纯合子突变和c.11 G>A杂合子突变均可致聋，但比戴翔等报道[4]携带率偏低。说明南宁市新生儿携带的致聋基因以GJB2 c.109 G>A为主，其它致聋突变位点携带率比较低。国外有报道[9-11]GJB2 c.-23+1 G>A为致聋位点，国内未见报道，本研究4例携带者为c.-23+1 G>A杂合子突变，听力正常，由于病例少，未检出纯合子突变，需要继续扩大样本量检测，才能深入研究证实该位点纯合子突变是否致聋。

表1 1 007例新生儿耳聋基因GJB2检测各位点突变携带率(n=100)

表2GJB2c.109G>A携带率与其它城市结果比较[n(%)]

类别n携带率n(%)χ2P值 南宁[本研究]1 007205(20.36)——北京[5]91536(3.93)133.3640.000台湾[6]5 173821(15.87)11.7240.001上海[7]1 516181(11.94)32.4490.000广东[8]53 03310 995(20.73)0.0850.771

3.2 250例携带GJB2突变位点 国内报道[4-5，12]c.368 C>A，c.316 T>G，c.341 A>G，c.79 G>A和c.608 T>C为中国人群最常见多态突变，结合听力确诊和追踪随访结果，携带者听力正常，提示以上5个突变位点携带者致聋风险机率很低。

3.3 GJB2突变的新位点与致病情况 研究有81例检出6个新突变位点，包括c.-23-35 G>T ，c.-121 G>A ，c.464 A>G， c.217 C>A，c.147 C>G和c.676 G>T，结合听力确诊和追踪随访结果，未发现听力损失，但均为杂合子突变，还不能证实其是否致聋，需要继续收集样本检测，才能确定纯合子突变与耳聋相关性。

综上所述，本研究依据1 007例南宁市新生儿跟踪随访、听力筛查、确诊和高通量测序血液中GJB2基因突变结果，筛查出4个致聋突变位点和6个新突变位点，1个未明确致病位点，明确了南宁市新生儿GJB2致聋基因携带率较高，致聋突变位点以c.109 G>A纯合子突变为主，为制定适合于南宁市新生儿耳聋基因筛查方法和遗传咨询提供可靠依据。