脂联素基因rs2241766多态性与代谢综合征的相关性研究

唐映华，杨 兰，莫武宁

(1.广西医科大学，南宁 530021;2.南宁市第二人民医院，南宁 530031；3.广西中医药大学第一附属医院，南宁 530023)

代谢综合征(metabolic syndrome, MS)是心血管及糖尿病的重要影响因素，可使心脏病患病风险增加2～3倍[1]。近年来MS的患病率明显上升[2]。脂联素(adiponectin, APN)是由脂肪组织分泌的激素蛋白,与高血压、糖尿病、冠心病和MS等疾病相关[3-5]。APN基因位于染色体的3q27区域，是2型糖尿病、MS及冠心病的易感基因区，具有丰富的基因多态性[6]。rs2241766是APN常见的多态性位点，本研究旨在通过检测MS患者APN水平及其基因位点rs2241766基因多态型(TT,TG,GG)及等位基因(T,G)的分布频率，探讨它们与MS发生的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取410例MS患者为MS组，其中男性234例，女性176例，年龄35～65(平均年龄50.4)岁，所有MS患者均按照《中国成年人血脂异常防治指南》[7]确诊为MS的患者。203例健康人群为对照组，其中男性109例，女性94例，年龄32～61(平均年龄45.9)岁。所有研究对象在纳入时均完成了身高(167.2±13.7cm vs 167.8±14.4cm)、体重(66.4±5.9kg vs 61.9±7.1kg)、腰围(88.4±6.6cm vs 81.3±4.6cm)、臀围(105.4±11.3cm vs 93.9±8.2cm)及血压(收缩压137.5±20.5mmHg vs 109.5±15.7mmHg，舒张压82.4±12.5mmHg vs 72.1±8.2mmHg)的测量。测量结果显示MS组体重、腰围、臀围及血压等指标均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。但两组在性别、年龄及身高上差异无统计学意义(P>0.05)。本研究遵循知情同意原则，所有研究对象均属自愿参加。

1.2 仪器与试剂 日立7600全自动生化仪(日本日立公司)，9700扩增仪(美国 ABI公司)，RT-6000酶标仪(深圳雷杜公司)，超微量紫外分光计(美国赛默飞世尔公司)，电泳仪(北京六一仪器厂)，凝胶成像仪(珠海黑马生物公司)，APN试剂(美国GBD公司)，DNA抽提试剂(北京天根公司)。TG，TC，LDL-C，HDL-C及FPG试剂(罗氏公司) 。

1.3 方法

1.3.1 样本采集:抽取每个受试者静脉血5ml，分别置入干燥管和乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管中。将血样本以3 000 r/min 离心10 min，收集上清液至-20℃冷冻保存以备检测。血清用于三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、空腹血糖(FPG)及 APN 检测，EDTA抗凝血用于APN 基因位点多态性检测。

1.3.2 生化参数及APN检测：血清TG，TC，LDL-C，HDL-C及FPG检测按日立7600全自动生化仪及相关试剂盒说明书检测。使用酶联免疫吸附试验检测APN水平，并根据试剂说明书进行处理。

1.3.3 APN基因检测

1.3.3.1 全血DNA的制备：严格按照试剂说明书操作。采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism, PCR-RFLP)技术对APN基因进行检测。APN基因位点 rs2241766多态性检测上游引物为5’-CTTGGTGAGGAGAGAGAGAC-3’，下游引物为5’-GGAGAATCAGATAATGATG-3’。

1.3.3.2 反应体系：在50μl总体积的反应体系中进行，包含DNA模版2μl ，PCR混合反应液8μl(含脱氧核苷三磷酸缓冲液)，上下游引物各1μl，Taq DNA聚合酶0.5 μl和水37.5μl。

1.3.3.3 扩增条件:94℃ 5min预变性；94℃ 1min，55℃ 45s，72℃ 1min持续35个循环；72℃延伸 5min。

1.3.3.4 限制性片段长度多态性分析:取PCR扩增产物20μl，限制酶1μl，缓冲液3μl，水6μl，在37℃酶切1h后，最后经2g/dl 琼脂糖凝胶电泳分析酶切后的DNA产物，并判断基因型。每个研究参与者被分为三种可能的基因型之一。

2 结果

2.1 MS组与对照组血清中生化指标及APN水平 见表1。MS组血清APN和HDL-C水平低于对照组，而FPG，TG，TC及LDL-C等水平高于对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。

2.2 rs2241766位点基因型及等位基因频率 见表2。经H-W平衡检验，rs2241766 的基因型和等位基因频率分布达到平衡(χ2=3.319,P=0.068;χ2=3.808,P= 0.079)。rs2241766位点的TT，TG及GG基因型在MS组与对照组间的总体分布上差异有统计学意义(χ2=39.222，P<0.001)，MS组GG基因型高于对照组且G等位基因频率也明显高于对照组，差异均有统计学意义(χ2=36.657，P< 0.001)。

表1 MS组与对照组血清生化指标及APN水平比较

表2 MS患者与对照组rs2241766 基因检测结果 [n(%)]

2.3 rs2241766 不同基因型发生MS的风险比较 logistic回归分析显示:rs2241766位点的TG (OR=1.55 ， 95% CI：0.79～2.83)和GG(OR=2.48 ， 95% CI：1.67～7.35)基因型发生MS的风险高于TT(OR=1.00ref)基因型，将TG和GG基因型合并，TG+GG(OR=2.23，95% CI：1.21～6.09)基因型发生MS风险同样高于TT，差异均有统计学意义(P=0.019,0.006，0.029)。等位基因T,G与MS发生的相关性分析发现，MS组G等位基因发生MS的风险高于T等位基因(OR=2.19 ， 95% CI：1.17～3.01 vs OR=1.00ref)，差异有统计学意义(P=0.034)。

2.4 MS组脂联素基因多态性与血清APN水平的关系 进一步对各基因型间的APN水平进行分析，发现GG基因型(14.3±4.5 mg/ml)和TG基因型(15.7±4.1 mg/ml)的APN水平明显低于TT基因型(18.7±4.9 mg/ml)， 将TG和GG基因型合并后发现TT+GG基因型(14.9±5.1mg/ml)的APN水平同样低于TT基因型(F=7.621,P<0.001)。而TG，GG及TG+GG组间ANP水平无差异。

3 讨论

MS是一组复杂的代谢紊乱，由多基因和多种环境相互作用导致的疾病。该病近年在60岁以上人群的患病率从25.5%上升到32.4%[8]，是糖尿病与心血管疾病(CVD)的重要危险因素。许多MS患者最终会发展为CVD和肾脏疾病，导致心脑血管病的发生率和病死率居高不下[9]。

APN是脂肪组织特异性分泌的激素蛋白，可促进代谢功能并提供心血管保护[10]，目前被认为是 MS的生物学标记物[11]。本研究结果显示MS患者血清APN水平明显低于健康人群(P<0.001)，表明APN水平降低与MS的发生密切相关，提示APN在MS的发生、发展中起着重要的作用，这与相关报道一致[12-14]。在APN基因rs2241766位点多态性基因型(TT,TG,GG)和等位基因(T,G)频率分析中发现，MS组GG基因型分布频率明显高于对照组(P<0.001)，G等位基因在MS组较对照组更为常见。对年龄进行调整后logistic回归分析显示TG和GG基因型的研究对象相对于TT基因型发生MS的风险分别增高1.55倍和2.48倍。与T等位基因研究对象相比，G等位基因研究对象发生MS的风险增高2.19倍。进一步对TT，TG及GG基因型组间的APN水平进行比较，结果显示GG基因型和TG基因型研究对象的APN水平明显低于TT基因型。提示TG和GG基因型研究对象可能会使APN水平降低，更容易发生MS，表明这种基因型是MS的危险因素。这与之前[15-17]的研究报道基本一致。此外，毛维维等[18]学者提出肥胖患者更容易出现代谢功能异常。顾进等[19]人也指出肥胖是一种低度炎症性的代谢紊乱。本研究结果显示，MS患者与对照组间的血糖、血脂、血压和体重的差异均有统计学意义。MS组FPG，TG，TC，LDL-C，体重及血压等指标明显升高。间接反映了肥胖者脂肪组织 TG，TC 贮存代谢能力和胰岛素抵抗程度有关，致使APN水平降低。

综上，APN基因rs2241766位点变异可能与MS发生相关。尤其是T向G变异的个体可能导致APN水平降低，更容易发生MS。