馆藏清代《牧牛图》轴的微生物病害研究

张 诺，徐 森

(南京博物院，江苏南京 210016)

0 引 言

我国拥有卷帙浩繁的书画文物。这些书画文物是古代先人留给我们的极其珍贵的历史文化遗产，是中华民族宝贵的精神财富。书画文物流传至今，面临着酸氧老化、断裂脱浆、虫蛀霉烂，岌岌可危。其中，微生物损害是书画文物中较为常见的病害。微生物具有分布广、对环境适应能力强、代谢转换能力强、繁殖速度快等特点，且在一开始生长的阶段很难发现，但当被发现时已经蔓延扩散。组成书画文物的材料——纸张、绢丝及浆糊等也都是微生物喜好的养料。所以，书画文物更容易受微生物的侵染。

近年来，微生物技术已经出现在文物保护中，在壁画、纸质文物、木质文物等方面取得了一定的研究成果[1-4]。这些技术为文物保护开辟了一个全新的领域，如今文物保护微生物学作为一门独立的学科出现在学术界[5]。利用这些新技术可以研究损害文物的微生物的种类，微生物对壁画、纸质、木质类文物材质的降解机理，从而为文物的保存及除霉工作提供技术指导。书画文物受到微生物侵染后，会留下微生物滋生的痕迹，出现黑色、黄色、红色等斑点，轻则损坏纸张部分纤维，重则使文物腐烂。早在20世纪30年代，人们就注意到纸质文物上出现的黄色、黄褐色、铁锈色的斑点，称之为狐斑(fox spots)[6]。目前，关于狐斑的成因，有些研究者更倾向于“生物论”的观点，即认为狐斑的成因主要可能与某种或某几种真菌的生长有关[7-8]。Arai[9]从不同纸张的褐色斑点(狐斑)处分离得到25株真菌，并认为这些斑点的形成与高温、高湿的环境相关，Corte等[10]也从地图的狐斑样品中分离得到真菌，并揭示了其与环境的相关性。

为全面了解馆藏书画文物的微生物病害信息，该研究工作包括了以下内容：对淮安楚州博物馆旧藏《牧牛图》轴的画芯和镶料及褙纸等处出现的微生物损害展开调查；对《牧牛图》轴上的黑色污斑和红色污斑处的微生物进行培养、分离纯化及鉴定。该项工作通过对这些污斑的分析检测探讨了微生物的损害机理，可为后续馆藏书画文物的预防性保护工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1书画样品 书画样品来自于《牧牛图》轴。《牧牛图》轴为淮安楚州博物馆旧藏，其画芯、镶料和褙纸等处出现严重的污渍和微生物损害。现场调研时发现该图轴存放的库房中无温湿度控制系统、密集柜内也未做防霉处理，致使本体材料出现多处变色，现状照片见图1。淮安为国家级历史名城，该画作对于研究清代淮安地区的民俗、民风具有重要的意义。

图1 《牧牛图》轴病害现状

1.1.2培养基制备 牛肉膏蛋白胨培养基：依次称取蛋白胨10 g、氯化钠10 g、酵母膏5 g、琼脂15 g于烧杯中，加入适量的水并加热使其溶解，后定容至1 000 mL，调pH值至7.4～7.6，1×105Pa灭菌30 min。液体培养基与固体培养基的成分相同，但不加琼脂。

马铃薯葡萄糖培养基：去皮马铃薯200 g，加适量的水煮沸30 min后，用八层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖20 g、琼脂15 g，后定容至1 000 mL，自然pH值，1×105Pa灭菌30 min。液体培养基与固体培养基的成分相同，但不加琼脂。

1.1.3试剂及主要设备 基因组提取采用北京百泰克生物科技有限公司基因组DNA提取试剂盒。聚合酶链式反应(PCR)扩增引物：细菌为24F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)、真菌为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)，Taq DNA聚合酶，缓冲液体系(Green PCR试剂)均由南京金斯瑞公司提供。基因序列测定委托苏州金唯智生物科技有限公司。

PCR仪为德国Biometra公司2720型；凝胶成像系统为美国Bio-Rad公司170-8170型；电泳仪为北京市六一仪器厂DYY-6C型；酸碱度测试计为美国CLEAN仪器pH30型；微波水分仪为德国ABB公司L&W 862型；扫描电子显微镜为日本日立公司S-3400N型。

1.2 实验方法

1.2.1书画本体分析检测 采用酸碱度测试计在样本上选择4点进行测试。采用微波水分仪测试样本的含水率。采用扫描电子显微镜(SEM)观察样本污渍处的显微形貌。

1.2.2样品的采集 用无菌棉签在样品污斑处(黑色污斑处为Sample 1，红色污斑处为Sample 2)轻轻摩擦，后置于无菌水中，震荡混匀。分别取混匀液100 μL接种于适宜微生物生长的无菌牛肉膏蛋白胨和马铃薯葡萄糖固体培养基上。

1.2.3微生物的分离和纯化 将接种完的牛肉膏蛋白胨和马铃薯葡萄糖固体培养基置于恒温培养箱中，分别于37 ℃和28 ℃条件下培养，期间陆续在培养基上得到菌落。随后，采用平板划线法，接种换取样于新的培养基中，重复纯化3次，最终为单菌落。

1.2.4微生物的形态观察 采用解剖针刮取少量纯化菌株于载玻片上，盖上盖玻片，在光学显微镜(OM)下观察形态特征并拍照保存。

1.2.5基因组DNA的提取 细菌总DNA的提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒(BacteriaGen DNA Kit)。真菌总DNA的提取方法如下：取适量纯培养物置于100 μL微生物裂解试剂盒(Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR)中，于80 ℃中水浴20 min，直接作为DNA模板用于后续PCR。

1.2.6PCR扩增[11]细菌扩增的引物序列为24F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)。PCR反应体系为50 μL，其中24F、1492R各1 μL，Taq酶0.5 μL，10×PCR缓冲液5 μL，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)4 μL，MgCl24 μL，DNA模板1.5 μL，无菌双蒸水33 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸100 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。真菌ITS基因片段扩增的引物序列为ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反应体系为50 μL，其中ITS1、ITS4各1 μL，Taq酶0.4 μL，10×PCR缓冲液5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，DNA模板2 μL，无菌双蒸水33.6 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s；58 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR扩增完毕，产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测纯度。

1.2.7序列比对 待测细菌的16S rDNA和真菌的内源转录间隔区(internally transcribed spacer，ITS)序列经过DNAMAN 6.0软件校正后，在美国国立生物技术信息中心(NCBI)中进行同源性序列搜索(BLAST search)。

1.2.8酶活测定 由于微生物具有不同的酶学系统，致使它们可以利用不同或者相同的底物产生不同的代谢产物。微生物的活性和生长繁殖与细胞外分泌的酶相关。研究各种胞外酶活性及作用是研究微生物致病机理的一个重要方面。为评估《牧牛图》轴上分离得到微生物的代谢和破坏能力，采用法国API-ZYM半定量微量方法系统测定了微生物19种胞外酶——碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14)、白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶的活性。该试剂盒专为研究酶活性所设计，包括4种酯酶、5种蛋白酶、2种水解酶和8种糖发酵酶。

1.2.9模拟样品的制备 挑取纯化菌株孢子，将孢子分散于马铃薯葡萄糖液体培养基中，放入恒温培养震荡器中，28 ℃，125 r/min过夜培养制成孢子菌悬浮液。然后用喷雾器将稀释后的孢子悬液喷洒到宣纸纸样表面，放入培养箱中，保持湿度为80%、温度28 ℃。

2 结果与分析

2.1 书画本体分析检测结果

样本的pH值在3.72～5.06范围，酸度值偏高；样本的含水率为12%，远远超出了纸张正常含水率水平；污斑样本在扫描电子显微镜下放大500倍，可见表面布满菌丝，如图2a所示。纸张本体含水率过高会导致微生物的孳生，微生物代谢产生的有机酸又会增加载体的酸度，这些因素造成书画本体腐蚀、破碎，如图2b所示。

图2 《牧牛图》样本扫描电子显微图

据研究报告[12]，微生物代谢中产生的有机酸主要有柠檬酸(青霉)、葡萄糖酸(青霉和曲霉)、甲酸、乳酸、延胡羧酸、丙酸、五倍子酸、丁烯二酸(根霉)等十几种酸。这些有机酸同无机酸一样可明显加大纸张酸性，使纸张变黄发脆，强度降低，是影响纸张寿命的主要因素。

2.2 分离纯化结果

书画文物Sample 1和Sample 2处共获得7株细菌和6株真菌，用接种针挑取少量已纯化菌株于载玻片上，于显微镜下观察、拍照，其中，F1-1～F1-3为Sample 1处分离纯化得到的真菌(图3a～3c)，F2-1～F2-3为Sample 2处分离纯化得到的真菌(图3d～3f)。

2.3 鉴定结果

利用BLAST检索对测序结果进行序列比对，结果表明：提交的13个序列分属于4个细菌属和5个真菌属，具体结果见表1和表2。7株细菌属于4个属：芽孢杆菌属(B1-1、B1-2、B2-2)、微球菌属(B1-3、B2-3)、假单胞菌属(B1-4)和葡萄球菌属(B2-1)。6株真菌属于5个属：根霉属(F1-1)、耙齿菌属(F1-2)、裂褶菌属(F1-3、F2-3)、蜡质菌属(F2-1)和腐霉菌属(F2-2)。

单菌落培养发现：F1-1菌株(Rhizopusoryzae)在培养后期会产生黑色颗粒，而Sample 1为黑色污斑样品，故F1-1(Rhizopusoryzae)可能与黑色污斑上的污染物相关。而据文献报道[13]，根霉属为纸张常见的霉变种属。同时，F2-3菌株(Schizophyllumcommune)在培养后期会产生红色色素，这也可能会导致样品表面产生红色污渍。为了验证这种推测，本研究通过模拟实验(详见1.2.9部分)，挑取F1-1菌株孢子作为受试菌，将其分散于马铃薯葡萄糖液体培养基中，并将制成的孢子菌悬浮液喷洒到宣纸纸样上。通过一段时间的培养，模拟纸样上遍布了黑色的斑点。从而，这也证实了推测的可能性，后续将采用质谱等检测手段做进一步研究。

图3 油镜下菌株的显微形态

表1细菌鉴定结果

Table1Identification of bacterial strains

取样处菌株编号参考序列号同源菌株种属相似度/%Sample 1B1-1KP422465.1Bacillus sp. B1408芽孢杆菌属99B1-2EU685816.1Bacillus sp. PK-14芽孢杆菌属99B1-3EU182882.1Micrococcus sp. MH54 微球菌属99B1-4FJ416144.1Pseudomonas sp. BSw10041N假单胞菌属98Sample 2B2-1EU798945.1Staphylococcus sp. JY04葡萄球菌属99B2-2EU236740.1Bacillus sp. Z9芽孢杆菌属99B2-3DQ490458.1Micrococcus sp. KVD-1921-02微球菌属99

表2 真菌鉴定结果

2.4 酶活测定结果

为探究书画文物上分离的微生物的生物降解能力，采用API-ZYM系统测定分离得到微生物的4种酯酶(碱性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、类脂酶(C14))、5种蛋白(多肽)酶(白氨酸芳胺酶、缬氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶)、2种水解酶(酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶)和8种糖发酵酶(α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-糖醛酸苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-岩藻糖苷酶)，结果见表3。本研究发现：分离的细菌的胞外酶主要有酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)；真菌的胞外酶主要有碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、酯酶(C4)、类脂酯酶(C8)、白氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶及N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶。

书画文物是有机质文物，属植物纤维类。其主要化学成分是纤维素、半纤维素、木质素，还有少量的果胶、无机盐等次要成分。绢丝等作为书画文物的镶料也常成为微生物的侵蚀对象。纤维素主要是以微纤维的形态存在于细胞壁的初生壁中；半纤维素分布在微纤维中间；木质素等包围在微细纤维和细纤维周围。它们三者相互交联在植物细胞壁的初生壁中。微生物是异养型生物，主要是通过一些胞外酶，将有机质文物中的高分子水解成能通过细胞膜的小分子物质，后者被微生物的细胞吸收利用，这也是文物被腐蚀破坏的过程。这些胞外酶加速了微生物代谢中有机酸和无机酸的产生，酸性物质和一些酶协同又加速了书画材质的老化。仲雨薇[14]采用蒽酮检测法分析了菌斑处碳水化合物的含量，并推测得出：霉菌使纸张原本不溶性的纤维素、半纤维素等降解为可溶性化合物，并最终导致污染处的纸张易断裂。微生物的代谢和产酶与作用底物密切相关，后续将考虑基于纤维素、半纤维素、木质素为单一碳源，分析菌株的产酶特性。

表3 API-ZYM测定结果

注： “+”表示阳性(存在)；“-”表示阴性(不存在)。

3 讨 论

微生物病害是书画类文物较为常见的病害，属于活动性病害和可诱发性病害[4]，应尽早预防和治理。随着预防性保护理念的日益深入，监测微生物污染已成为近年来预防性保护研究的一个新方向[3]。López-Miras等[15]采用API-ZYM系统对从油画上分离得到的细菌和真菌的酶活进行了测定，并认为酯酶和类脂酯酶会造成油画的损坏。纤维素酶通常包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-糖苷酶。曲霉属、木霉属、青霉属被认为能产生高活性的纤维素酶[3]。而不同菌体中，纤维素酶系的组合是各不相同的。本研究采用的API-ZYM系统中没有涉及到内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶，后续将基于纤维素、半纤维素、木质素为单一碳源，并分析菌株的酶学性质。

纸质文物上孳生微生物的现有研究大多数是针对真菌，尤其是丝状真菌(俗称为霉菌)。近年来，越来越多的研究者开始关注细菌对书画文物的危害。芽孢杆菌属、假单胞杆菌属和微球菌属是其中最常见的菌种[16]。有研究[17]发现：在一套被菌斑严重侵蚀的摄影材料中，包括正片、底片、纸质框和玻璃纸的信封，细菌和真菌在同一个生态位置共同的生长。所以，虽然不同细菌对生长环境各有偏好，但是细菌和真菌是可以在纸张这个微环境中共同存在的。许多纸张在久藏后，表面出现各种颜色的斑点，其形成并不一定是细菌或是真菌单方面作用的结果，也可能是两者协同的效应，这些微生物在载体材料上群居杂生，势必共同影响着纸张的老化降解。

4 结 论

本研究对淮安楚州博物馆馆藏的《牧牛图》轴上黑色污斑和红色污斑处样品进行分离及鉴定后发现：分离菌株分属4个细菌属和5个真菌属，主要有芽孢杆菌属、裂褶菌属和根霉属。酶活结果显示：细菌的酯酶和类脂酯酶与微生物腐蚀相关；真菌的酯酶、类脂酯酶及N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶等与微生物腐蚀相关。酯酶类可催化植物纤维细胞壁中酯酶的水解；N-乙酰-β-氨基葡糖苷酶可水解细胞壁和蛋白酶类。这些胞外酶水解造纸纤维细胞壁中脂类和多糖类物质、颜料中的胶料以及镶料绢丝中的蛋白质。本研究为了解书画文物侵染的微生物种类和数量及后续保护修复过程提供参考，具有重要的指导意义。

在环境温度为22～30 ℃、相对湿度大于65%的条件下，书画的有机材质适宜微生物的生长。因此，根据书画载体的材质和微生物的类型及其生理特征，可从3个方面制定相关的保护措施：1)控制孢子源头，通过书画文物入库前的检查，可定期对其进行消毒进而降低存储空间书画文物发生霉变的几率；2)控制环境温湿度，为保证存储环境温度和相对湿度的稳定，可采用空调系统控制，但是适当的自然通风、保持室内空气的适当流动也是防止微生物孳生的有效方法；3)采用相应的防霉剂。事实上，文物所处的环境不可能做到无菌，微生物防治工作的重点是“防”，如果“防”的工作做好了，“治”就不显得格外重要。通过定期对书画文物及存放空间中的微生物进行检测，评价微生物污染的状况，检测方法可参照《馆藏文物保存环境质量检测技术规范》(WW/T 0016—2008)，从而建立微生物综合防治体系，为科学有效解决微生物病害提供保障。