正交试验法优选香芎凝胶贴膏处方提取工艺

杨晓日 李咏梅 张俊生

[摘要] 目的 优选香芎凝胶贴膏处方最佳提取工艺。 方法 采用醇提工艺，以阿魏酸和王不留行黄酮苷的提取率和处方的出膏率为指标，以正交实验设计考察提取过程中乙醇浓度、提取倍数、提取时间等条件对各指标的影响，优选出最优醇提工艺。并进行验证试验。 结果 最优醇提工艺为加入8倍量60%乙醇，提取2次，每次1.5 h。结论 该工艺合理可行，有效成分提取率高，重复性好。可为香芎凝胶贴膏现代制剂的开发提供技术参考。

[关键词] 香芎凝胶贴膏;正交试验;阿魏酸;王不留行黄酮苷;出膏率;提取工艺

[中图分类号] R283.6          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）02（c）-0123-04

[Abstract] Objective To optimize the extraction process of Xiangxiong Gel Plaster. Methods The ethanol extraction process was used， the extraction rate of ferulic acid and flavone glycoside and the extract rate of prescription as the indexes， the orthogonal experimental design was used to investigate the influence of ethanol concentration， extraction times， extraction time and other conditions in the extraction process on each index， and the optimal extraction process was optimized. And a verification test was carried out. Results The optimal ethanol extraction process was to add 8 times of 60% ethanol and extract  twice， with 1.5 h each time. Conclusion The process is reasonable and feasible， the effective component extraction rate is high， the repeatability is good. It can provide technical reference for the development of Xiangxiong Gel Plaster.

[Key words] Xiangxiong Gel Plaster; Orthogonal test; Ferulic acid; Flavone glycosides from codonopsis; Extract rate; Extractprocess

香芎散是烟台市中医医院心内科临床外用经验方剂，由川芎、王不留行、香附、没药、乳香等组成，具有活血止痛理气的作用[1-5]。临床上用于治疗肝郁气滞、气滞血瘀所致的冠心病、心脏神经官能症、高血压、高血脂等代谢综合征。课题组拟将其研制成中药复方经皮给药制剂，即香芎凝胶贴膏[6-10]。在提取工艺研究中，以阿魏酸王不留行黄酮苷的提取率和出膏率为指标，优选最优醇提工艺。

1 材料

1.1 仪器

Agilent Technologies 1260 InfinitⅡ;Milli-Q超纯水机;Es-E120BⅡ电子分析天平（天津市德安特传感技术有限公司0.01 mg）;DHG-9070A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学技术有限公司）;GM-0.33A隔膜真空泵（天津津腾实验设备有限公司）。

1.2 试药

川芎（山东商都药业有限公司，批号：18060202）;王不留行（安徽九州方圆制药有限公司，批号：201803 01）;阿魏酸、王不留行黄酮苷（中国药品生物制品检定所，批号分别为110773-201313、11853201303）;甲醇、乙腈（色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 香芎凝胶膏剂处方药材的核查

根据2015版《中华人民共和国药典（一部）》[11]（以下简称“《中国药典》”）的规定，对处方中各药材进行含量测定，结果川芎和炒王不留行含量分别为0.26%和0.23%，符合《中国药典》要求。

2.2 正交实验法优化香芎凝胶膏剂的提取工艺

2.2.1阿魏酸含量测定  色谱条件  色谱柱：Agilent EC-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）;填充剂为十八烷基键合硅胶;流动相：甲醇∶1%醋酸溶液（30∶70）;流速：1.0 mL/min;检测波长：321 nm;柱温：25℃。理论板数按阿魏酸峰计不低于5000。阴性对照液中色谱对测定无干扰。

对照品溶液的制备取精密称定的阿魏酸对照品，置于棕色容量瓶中，加70%甲醇配成0.12 mg/mL的溶液。供测定线性使用。取以上溶液按照《中国药典》要求配成20 μg/mL的溶液备用。

供试品溶液的制备  取处方药材30 g，按L9（34）正交实验设计表提取药材2次，合并提取液，用相应浓度的乙醇定容至1000 mL备用。

空白溶液的制備  称取除川芎外其余药材，回流提取（8倍量80%乙醇）2次，1 h/次，合并提取液，用相应浓度乙醇定容至1000 mL备用。

2.2.2 方法专属性考察  取供试品溶液、对照品溶液、川芎空白溶液10 μL，按上述色谱条件测定，供试品溶液和对照品溶液均在9 min左右现阿魏酸的特征吸收峰，川芎空白溶液则无特征吸收峰，方法专属性良好。见图1。

A：阿魏酸对照品溶液;B：供试品溶液;C：川芎空白溶液。1.阿魏酸

2.2.3 线性关系考察  分别精密吸取0.12 mL/min阿魏酸贮备液各0.5、1、2、3、4、10 mL置于10 mL棕色容量瓶中，分别稀释后得系列对照品溶液，各进样20 μL。横坐标为对照品的质量浓度，纵坐标为峰面积，回归方程：Y = 26 075X-19.894，r2 = 0.9998，阿魏酸在0.0123～0.246 mg/mL浓度范围内阿魏酸线性关系良好。

2.2.4精密度考察  取对照品溶液10 μL，连续测定5次，计算其平均峰面积为754.0676，RSD为0.13%。仪器精密度良好。

2.2.5 稳定性试验  吸取同一供试品溶液10 μL于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积，计算平均峰面积为1015.611，其RSD为4.33%。供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.2.6 重复性试验  同一供试品溶液6份，在上述色谱条件下测定。计算阿魏酸提取率，RSD为3.6%。方法重复性良好。

2.3 王不留行黄酮苷含量测定

2.3.1 色谱条件  色谱柱：Agilent TC-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;填充剂为十八烷基键合硅胶;流动相：A（乙腈）：B（水），梯度洗脱;流速：1.0 mL/min;检测波长：280 nm;柱温：25℃[7]。理论板数按王不留行黄酮苷峰计不低于5000。阴性对照液中色谱对测定无干扰。梯度洗脱程序：0～10.0 min，5%→10%A;10.0～85.0 min，10%→30%A;85.0～90.0 min，30%→30%A。

2.3.2 王不留行黄酮苷对照品溶液的制备  按《中国药典》王不留行黄酮苷对照品溶液的制备方法制备得0.1 mg/mL的溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备  取“2.2.1”项下制备的溶液备用。

2.3.4王不留行空白溶液的制备  取除王不留行外其余药材，照“2.2.4”项下的方法制备。

2.3.5方法专属性考察  分别取供试品溶液、王不留行黄酮苷对照品溶液，王不留行空白溶液10 μL，照上述色谱条件测定，供试品溶液和王不留行黄酮苷对照品溶液均在33 min左右现王不留行黄酮苷特征吸收峰，而王不留行黄酮苷空白溶液在此处无干扰，方法专属性良好。见图2。

A：王不留行黄酮苷对照品溶液;B：供试品溶液;C：王不留行黄酮苷空白溶液。2.王不留行黄酮苷

2.3.6 线性关系考察  分别取王不留行黄酮苷对照品溶液各1、2、3、4、5 mL置于5mL容量瓶中，稀释后得系列对照品溶液，分别进样10 μL。横坐标为对照品的质量浓度，纵坐标为峰面积，回归方程：Y = 17 083X-38.772，r2 = 0.9917，王不留行黄酮苷在0.01～0.05 mL/min范围内线性关系良好。

2.3.7精密度考察  取王不留行黄酮苷对照品溶液10 μL，连续测定5次，计算平均峰面积为1993.382，其RSD为0.82%。仪器精密度良好。

2.3.8穩定性试验  取同一供试品溶液10 μL分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定其峰面积，计算平均峰面积为248.502，其RSD为3.36%。供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.9重复性试验  同一供试品溶液6份，在上述的色谱条件下测定。计算王不留行黄酮苷提取率，其RSD为2.86%。方法重复性良好。

2.4 出膏率测定

取“2.2.1”项下的供试品溶液25 mL置于已知恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，105℃干燥3 h后移置干燥器中，冷却30 min后精密称定重量，出膏率=干膏质量（g）/药材总质量（g）x100%[8，12]。

2.5 正交试验法优选提取工艺

据预试验结果及参考文献[13-17]，将提取次数设2次，考察因素为乙醇浓度、乙醇用量、提取时间3个因素，每因素取3水平，以出膏率和阿魏酸，王不留行黄酮转移率做为评价指标，采用L9（34）正交表安排试验。见表1。

各因素对阿魏酸的转移率的影响程度依次为C>B>A，最佳提取条件为A3B2C2;各因素对王不留行中黄酮苷的转移率的影响程度依次为C>B>A，最佳提取条件为A2B3C2。见表2～4。

各因素对出膏率的影响程度依次为A>B>C，见表5。最佳提取工艺为A1B3C1。A、B、C三因素对实验结果差异无统计学意义（P > 0.05）。综合分析，建议最佳提取工艺为A1B2C2。

2.6 验证试验

按以上最佳工艺，60%乙醇，8倍加醇量，提取2次，每次1.5 h，对正交试验结果进行验证。最佳工艺中，阿魏酸平均转移率为61.84%，RSD%为0.27%;王不留行黄酮苷平均转移率为57.95%，RSD%为2.85%;平均出膏率为22.71%，RSD%为0.08%。见表6。

3 讨论

川芎为香芎外用方的君药，主要成分阿魏酸具有增加冠脉血流量、保护心肌缺血、抗血小板聚集等药理功效[17-24];王不留行为处方中的臣药，其主要成分王不留行黄酮苷具有降脂、抗心律失常、抗炎等药理作用。故选这两个成分的转移率及出膏率作为考察指标，筛选处方的最优提取工艺。

测定王不留行黄酮苷时，对不同的流动相系统进行了考察，结果显示，采用流动相：A（乙腈）：B（水），梯度洗脱。在此色谱条件下王不留行黄酮苷的色谱峰与相邻成分达到基线分离，理论板数按王不留行黄酮苷峰计不低于5000故选择乙腈-水作为其流动相。

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（收稿日期：2019-09-06  本文编辑：刘永巧）