气相色谱测定动植物中角鲨烯含量

张协光，蓝雄，彭祖茂，朱丽，李碧芳*

深圳市计量质量检测研究院，国家营养食品质量监督检验中心（广东）（深圳 518109）

角鲨烯又名鲨烯、鲨萜，是所有细胞中甾醇的前体，不饱和程度较高，是一种重要生物活性物质[1-2]。角鲨烯具有抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、抗心血管疾病、抗感染、提高免疫调节等多种生理功能[3]，因此被广泛应用于保健食品、医药及化妆品等行业。

鲨烯广泛存在于动植物体内，在动物中以深海鱼类，特别是鲨鱼的肝脏中含量最为丰富，在鲨鱼肝油中的最高含量可达69%，在日常接触的一些动物油脂，如平时食用的牛乳脂、猪油及牛油脂中也广泛存在角鲨烯；而它在植物中的分布也十分广泛[4]，在许多植物的根、叶、皮等部分都存在角鲨烯，如鼠尾草、烟叶、苋属植物和苔藓植物中亦含角鲨烯，植物中则以苋属植物的种子油中有较高含量的角鲨烯，含量达到5%～8%，橄榄油和棕榈油中含量也较高。苋属植物的种子油有望作为潜在的角鲨烯资源。目前，角鲨烯含量的测定方法主要有高效液相色谱（HPLC）

法[5-7]、气相色谱法[8-10]和气质联用法[11-14]。由于角鲨烯的极性较小，易溶解于非极性溶剂中，而液相色谱又以反相液相色谱应用为主，故检出限均高于气相色谱和气质联用色谱法而很少被应用于分析检测中。对于气质联用法而言，其对仪器要求比较严格，现还不能普及到大多的实验室中，故试验采用气相色谱法对动植物中的角鲨烯进行分析，气相色谱法测定中大多数采用有机溶剂溶解直接进样，不仅会污染色谱柱，还会缩短色谱柱的使用寿命。由于角鲨烯是一种脂质不皂化物，因此可将样品经酸水解，后用石油醚-乙醚混合试剂提取脂肪，然后进行皂化处理，萃取净化皂化液，从而可脱除样品中较多的杂质峰。试验建立了气相色谱测定动植物中角鲨烯含量的方法，以期对动植物中不同原料来源角鲨烯的含量分布及差异研究提供参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890 B配氢火焰离子化检测器（美国Agilent公司）；涡旋混合器（德国IKA公司）；恒温水浴锅（上海-恒科技有限公司）；氮吹仪（上海安谱实验科技股份有限公司）；分析天平（德国赛多利斯SARTORIUS）；组织粉碎机（北京鼎昊源科技有限公司）。

甲醇、正己烷、无水乙醇（色谱级，德国默克公司）；氢氧化钾、氯化钠、无水硫酸钠（分析纯，上海凌峰化学试剂有限公司）；盐酸（分析纯，东莞市东江化学试剂有限公司）；乙醚、石油醚（分析纯，广州化学试剂厂）；实验用水为Milli-Q超纯水。

标准物质：角鲨烯（纯度≥99%，Sigama-Aldrich）。

1.2 色谱条件

采用Agilent HP-5毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm，Agilent Technologies），载气为氮气（纯度99.999%）；空气流速400 mL/min，氢气流速40 mL/min，氮气流速2 mL/min，尾吹流速30 mL/min；检测器FID温度300 ℃，进样口温度250 ℃，进样量1 μ L，分流比20∶1；程序升温：初始温度160 ℃，保持1 min；以15 ℃/min升温至220 ℃，保持2 min，再以5℃/min升温至280 ℃，保持10 min。后运行300 ℃，时间2 min。

1.3 试剂配制

盐酸溶液（8.3 mol/L）：量取250 mL盐酸，用110 mL水稀释，混匀。

乙醚-石油醚混合溶液（1+1）：取等体积的乙醚和石油醚，混匀备用。

氢氧化钾-甲醇溶液（1 mol/L）：取5.6 g氢氧化钾溶解在100 mL甲醇中，混匀。

饱和氯化钠溶液：称取360 g氯化钠溶解于1.0 L水中，搅拌溶解，澄清备用。

1.4 标准溶液的配制

1.4.1 标准储备液的配制

准确称取0.1 g（精确到0.000 1 g）角鲨烯标准品到100 mL容量瓶，用正己烷溶解并定容，得到质量浓度为1 000 μg/mL标准储备液。此溶液在4 ℃下可保存6个月。

1.4.2 标准工作曲线的配制

分别取0.3，1.0，2.0，5.0和10.0 mL标准储备液于100 mL容量瓶中，定容，即得到质量浓度为3.00，10.0，20.0，50.0和100 μg/mL的系列溶液。将1 μL的标准系列浓度溶液注入气相色谱仪中，测得相应的峰面积，以标准工作液的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。

1.5 样品前处理

1.5.1 试样的制备

在采样和制备过程中，应避免试样污染。固体或半固体试样使用组织粉碎机，液体试样用匀浆机打成匀浆，在-18 ℃下冷冻保存，分析使用时将其解冻后使用。

1.5.2 非油脂类样品

称取0.1～1.0 g（精确至0.1 mg，含100～200 mg脂肪）均匀试样到100 mL具塞量筒中，加入2.0 mL乙醇和4 mL水，混匀，加入10 mL盐酸溶液，混匀。将具塞量筒放入70～80 ℃水浴中，水解40 min。每隔10 min振荡一下具塞量筒，确保在具塞量筒壁上的颗粒物混入溶液中。水解完成后，取出具塞量筒，冷却至室温。

水解后的试样，加入10 mL乙醇，混匀，然后加入50 mL乙醚-石油醚混合溶液，振摇5 min，静置10 min。用少量的乙醚-石油醚混合溶液冲洗具塞量筒和塞子，将醚层转移到250 mL烧杯中。按照以上步骤重复提取水解液3次，将3次收集的醚层合并到250 mL烧杯中。放置于水浴锅上蒸发至干，得到试样脂肪提取物。

1.5.3 油脂类样品

油脂类样品无需脂肪提取，直接按照1.5.4小节进行皂化及甲酯化。

1.5.4 皂化及甲酯化

非油脂类样品：将提取得到的脂肪用正己烷溶解并完全转移至25 mL比色管中，用氮吹仪吹干，加入1 mL 1 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液，在漩涡振荡器上振荡2 min，后准确加入5 mL正己烷，在漩涡振荡器上萃取1 min，用饱和食盐水洗涤至中性，静置，使水相和正己烷相分层。取3 mL正己烷相于10 mL玻璃试管中，加入约0.3 g无水硫酸钠进行干燥，将溶液过膜，待测。

油脂类样品：准确称取0.1～0.5 g（精确至0.1 mg）样品至25 mL比色管中，以后步骤同非油脂类样品“加入1 mL 1 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液……过膜，待测”。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件选择

由于角鲨烯易溶于非极性溶剂，一般采用弱极性色谱柱即可满足角鲨烯的分离和测定。角鲨烯是一种高度不饱和烃类化合物，分子质量大，沸点高（280℃），难挥发，因此试验选用非极性色谱柱HP-5耐高温（350 ℃）低流失弹性毛细管柱。进样口温度设为250 ℃，在此条件下，既可保证样品的充分汽化，又能保证固定液无流失[15]，色谱峰的分离效果好且基线较平稳。在此色谱条件下，角鲨烯标准品与样品的气相色谱图见图1。该条件下，色谱峰分离、峰型较好，保留时间短，亦没有基质干扰定量分析。

图1 不同样品角鲨烯气相色谱图

2.2 样品前处理条件优化

2.2.1 油脂样品

2.2.1.1 皂化试剂的选择

为了选择最佳的皂化试剂，试验选取了2种皂化试剂，即氢氧化钾-甲醇溶液（1 mol/L）、氢氧化钾-乙醇溶液（1 mol/L），并以橄榄油样品处理后角鲨烯的检出量作为指标，对以上2种皂化试剂进行对比。对于橄榄油样品，氢氧化钾-甲醇溶液的皂化效果最佳，角鲨烯的检出量为279±1.00 mg/100 g，而氢氧化钾-乙醇溶液的萃取效果稍差，角鲨烯的检出量只有256±0.577 mg/100 g，而且用饱和食盐水洗涤至中性时，正己烷与饱和食盐水不易分层，还有浑浊现象，氢氧化钾-乙醇溶液放置时间久还会变质变黄，故选择氢氧化钾-甲醇溶液为最佳的皂化试剂。

2.2.1.2 皂化时间的选择

选取1 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液为皂化试剂，考察了固定萃取时间2 min情况下不同皂化时间对角鲨烯含量的影响，皂化时间分别为1，2，3，4和5 min。按此次试验皂化方法进行皂化，最后GC分析检测，得出不同皂化时间对角鲨烯含量测定的影响，结果见图2。在所选的皂化时间段内，不同皂化时间对角鲨烯含量测定值的影响较小。因此，从经济角度和成本时间考虑，选择 2 min为最佳皂化时间。

2.2.1.3 萃取时间的选择选取1 mol/L氢氧化钾-甲醇溶液为皂化试剂，考察了固定皂化时间2 min情况下不同萃取时间对角鲨烯含量的影响，萃取时间分别为0.5，1，1.5，2和3 min。按此次试验萃取方法进行萃取，最后GC分析检测，得出不同萃取时间对角鲨烯含量测定的影响，结果见图3。在所选的萃取时间段内，不同时间对角鲨烯含量测定值的影响较小。因此，从经济角度和成本时间考虑，选择1 min为最佳萃取时间。

图2 不同皂化时间的影响

图3 不同萃取时间的影响

2.2.2 非油脂样品

为了选择最佳的非油脂样品前处理方法，试验研究了酸水解提取脂肪再皂化和直接皂化两种方法对角鲨烯含量影响，并以罗汉果样品处理后角鲨烯的检出量作为指标，对以上2种提取方式进行对比。酸水解提取脂肪再皂化法是将样品经酸水解，后用石油醚-乙醚混合试剂提取脂肪，后按照油脂样品处理方式进行皂化处理，测定样品中角鲨烯含量。直接皂化方法是称取试样后，加入5 mL的水、10 mL的无水乙醇和10 mL 50%的氢氧化钾水溶液，摇匀，在70 ℃摇床皂化60 min，后冷却至室温；用正己烷萃取3次，将3次收集的正己烷层合并到250 mL分液漏斗中，用约100 mL的水重复洗涤3次，直至正己烷层洗涤至中性（可用pH试纸检测下层溶液pH），除去下层水相；将洗涤后的正己烷层经无水硫酸钠（约3 g）滤入250 mL旋转蒸发瓶，用约15 mL正己烷冲洗分液漏斗2次，并入蒸发瓶内，在40 ℃水浴中减压蒸馏，待瓶中正己烷剩下约2 mL时，取下蒸发瓶，立即用氮气吹至干；准确移取5 mL正己烷溶解，过膜，待测。两种前处理方法的结果如表1所示。

结果表明，对于罗汉果样品，采用酸水解提取脂肪再皂化的提取方式，角鲨烯的检出量为44.6±0.577 mg/100 g，而直接皂化的提取方式，角鲨烯的检出量仅有23.8±1.00 mg/100 g，可能是酸水解法更有利于样品中结合态的角鲨烯游离，同时较直接皂化反应步骤少，耗时短。故选择酸水解提取脂肪再皂化为最佳的非油脂样品前处理方法。

2.3 线性范围、检出限和定量限

将角鲨烯标准溶液进行梯度稀释后，按照1.2气相色谱条件进行测定，考察方法线性。以峰面积Y为纵坐标，标准质量浓度系列X为横坐标，绘制标准曲线，其标准曲线方程为Y=2.072 2X+0.446 3，线性范围为3.00～100 μ g/mL，相关系数r为0.999 9，表明角鲨烯质量浓度在3.00～100 μg/mL范围内具有较好的线性关系。以3倍信噪比（S/N=3）计算方法的检出限，以10倍信噪比（S/N=10）计算方法的定量限，其中角鲨烯的检出限LOD和定量限LOQ分别1和3 μg/mL。当称样量为1.0 g，定容体积为5.00 mL时，样品检出限LOD为0.5 mg/100 g，定量限LOQ为1.5 mg/100 g。详见表2。

表1 非油脂样品前处理方法对角鲨烯含量的影响

表2 方法的线性范围、回归方程、相关系数、检出限、定量限及精密度RSD（N=6）

2.4 回收率和精密度

对橄榄油、罗汉果、带鱼三个不同的样品进行测定，按样品中角鲨烯含量添加三个水平进行回收率试验，按照1.5节样品前处理方法对样品进行处理，每个添加水平进行6次重复测定。样品测定值、加标量、回收率详见表3。角鲨烯的平均回收率在91.5%～99.7%之间，RSD为0.929%～3.26%，回收率满足GB/T 27404—2008分析方法要求。

2.5 动植物样品角鲨烯含量的测定

表4 五种动植物样品的角鲨烯含量分析

采用上述方法对一批鱼油、稻米油、牛油脂、核桃4种常见动植物样品进行测定，结果见表4。结果显示，所测4种动植物样品中均检出角鲨烯，具体含量分别为鱼油平均含量15.9 mg/100 mg、稻米油平均含量13.1 mg/100 mg、牛油脂平均含量9.81 mg/100 mg、核桃平均含量2.39 mg/100 mg。该方法简单、稳定、灵敏度高，可广泛应用于动植物中角鲨烯含量的测定。

3 结论

试验建立了气相色谱测定动植物中角鲨烯含量的方法，并进行了方法学考察。结果显示，试验方法测定动植物样品加标有较好的回收率，重现性好，灵敏度高，能够满足对样品检测的要求，同时该方法分离度高，方法可行，定量准确。通过对几种常见的动植物样品进行分析测定，确定了所测动植物中角鲨烯的含量，后续通过检测更多种类的动植物样品，能够对动植物中角鲨烯含量的分布差异有更加全面的认识。

该方法实现了对动植物样品中不同原料来源角鲨烯的检测，这不仅为动植物中角鲨烯含量差异的研究提供了一种简洁、高效的方法，也为其它类型样品中不同原料来源角鲨烯的检测提供了参考依据。