环黄芪醇对异丙肾上腺素诱导小鼠心肌纤维化的影响*

董 雪， 范宏伟， 胡丙雪， 张 茵， 张 朝

(南京师范大学生命科学学院， 江苏省分子与医学技术重点实验室， 江苏 南京 210023)

心肌纤维化(cardiac fibrosis，CF)是心室重构的主要表现之一，是大多数心血管疾病发生的重要病理过程[1],其主要表现为心脏成纤维细胞过度增殖，细胞外基质的合成和降解失衡，胶原沉积增多、密度增大,这些病理改变使心脏僵硬度增加，顺应性降低，从而导致心脏功能减退，最终发展为心衰和心律失常等心脏疾病[2]。因此，阻止CF的发生对于多种心血管疾病的治疗非常重要。然而，CF的发病机制还不清楚，目前还没有治疗CF的有效手段。

引起CF的病因很多，缺血损伤、压力负荷等都会导致其发生[3]，并且CF的发展是一个复杂的病理过程，炎症反应和氧化应激都与之密切相关。大量研究证实炎症反应在CF的发展中起着关键作用[4]。当心脏受到缺血或缺氧等损伤时，炎症细胞被募集到受损组织分泌炎症因子和促纤维化生长因子，这些因子促进细胞外基质(extracellular matrix，ECM)过度沉积，最终导致纤维化发生[5]。同时，炎症细胞产生的炎症因子,如肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)能够通过激酶介导的磷酸化反应激活核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)信号通路，引发炎症反应[6]。此外，当心脏受到压力负荷等应激时，细胞产生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，过量的ROS如果无法及时清除，将会引起氧化应激。ROS一方面可以通过激活NF-κB信号通路，促进炎症相关信号分子的表达[7]；另一方面可以通过产生促纤维化因子如转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)，调节上皮-间充质转化而促进CF[8]。因此，调控炎症反应和氧化应激有望成为治疗CF的重要策略。

黄芪甲苷(astragaloside，AST)是中药黄芪的主要活性物质，药代动力学结果证明，AST在生物体内代谢为环黄芪醇(cycloastragenol，CAG)，CAG是其发挥生物学作用的主要成分[9]。CAG具有抗氧化、抗衰老和抗炎等重要的生物学作用[10]，研究指出，CAG可以缓解博来霉素刺激产生的肺纤维化，从而减轻肺功能损伤[11]。本实验旨在探索CAG对CF的影响及潜在的分子机制。

材 料 和 方 法

1 实验材料

CAG纯度为98%，购自成都瑞芬思生物科技有限公司，用DMSO溶解，储存于-20 ℃。异丙肾上腺素(isoproterenol, ISO)购自Sigma-Aldrich，用生理盐水溶解，现用现配。本实验所用抗体均购自Cell Signaling Technology。

2 实验动物

SPF级C57BL/6小鼠购自南京大学模式动物所，饲养于IVC系统中，温度(24±2) ℃，湿度(50±10)%，12 h/12 h明暗光照，自由进食进水。文中涉及的所有动物实验操作符合动物实验伦理学标准，并得到伦理委员会的批准，许可证号为SYXK(苏)2015-0028。

3 方法

3.1动物实验分组与给药 选取7～8周龄小鼠，体重(22±3) g。随机分为对照(CTL)组、ISO模型(ISO)组、CAG低剂量与ISO模型[CAG(L)+ISO]组、CAG高剂量与ISO模型组[CAG(H)+ISO]和DMSO溶媒对照(DMSO+ISO)组，每组14只小鼠。CTL组小鼠每天腹腔注射和灌胃生理盐水。ISO给药方案是：第1天20 mg/kg，第2天10 mg/kg，此后保持5 mg·kg-1·d-1，共给药4周。CAG与ISO共同给药组和DMSO溶媒对照组，在ISO给药前1周分别灌胃CAG或DMSO，此后与ISO共同给药至实验结束。给药方案具体见图1。

Figure 1.The effects of CAG on mouse survival. A: Schematic diagram showing experiment procedure. CTL: control group; ISO: isoproterenol group; CAG/DMSO+ISO: cycloastrogenol or DMSO co-treatment with isoproterenol group.B: Kaplan-Meier survival curves in the entire cohort.

图1 动物实验流程及CAG对小鼠存活率的影响

3.2心脏成纤维细胞的培养 从新生SD大鼠(出生1～2 d)的心室组织中分离原代心脏成纤维细胞。具体操作为用胶原酶消化心室组织并收集细胞，利用差速贴壁法去除上层培养液中未贴壁的心肌细胞，贴壁的成纤维细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃(5% CO2)培养箱中。来自第3代的成纤维细胞用于后续实验。

3.3超声心动图检测 采用Vevo 2100系统(VisualSonics)对小鼠进行无创二维超声检测。用2.4%的三溴乙醇腹腔注射麻醉小鼠(250 mg/kg)，探头频率为30 MHz，扫描获得二维M-mode和脉冲波多普勒超声影像。软件分析，计算获得表征心功能的各项指标。

3.4Masson三色染色 心脏组织石蜡切片脱蜡。苏木素染液染5 min，1%盐酸乙醇分化数秒，自来水冲洗。丽春红酸性品红液处理5 min，用蒸馏水快速漂洗。磷钼酸水溶液处理3 min，苯胺蓝复染5 min，1%冰醋酸处理1 min。将切片脱水至透明，用中性树胶封片，显微镜观察。

3.5RT-qPCR实验 用ChamQTMSYBR® qPCR Master Mix试剂盒(High ROX Premixed，Vazyme)检测相关基因转录水平的表达情况。引物序列见表1，β-actin为内参照，用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列

NOX4: NADPH oxidase 4; iNOS: inducible nitric oxide synthase; α-SMA: α-smooth muscle actin; Col-I: collagen type I; Col-III: collagen type III; TNF-α: tumor necrosis factor-α; IL-1β: interleukin-1β.

3.6Western blot检测蛋白水平 提取小鼠心脏组织蛋白，BCA法蛋白质定量。SDS-PAGE分离后转膜，5%的脱脂牛奶室温下封闭膜1 h，4 ℃孵育 I 抗过夜，室温下孵育 II 抗1 h，利用化学发光法成像。

3.7免疫组织化学染色 心脏组织石蜡切片脱蜡、水化，热抗原修复。用3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，孵育相应的 I 抗过夜及 II 抗，滴加链霉菌抗生物素-过氧化物酶溶液，室温孵育10 min。用二氨基联苯胺溶液染色，苏木素染液复染1 min，1%盐酸酒精分化3 s。切片经过脱水后，用中性树脂封片，显微镜观察。

4 统计学处理

用Origin 8.0、Photoshop和ImageJ等软件进行统计学分析和图表制作。动物实验数据以均数±标准差(mean±SD)表示，细胞实验数据以均数±标准误(mean±SEM)表示。多组样本之间的差异比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，采用Tukey法进行两两比较。以P<0.05为差异具有统计学显著性。

结 果

1 动物实验给药流程及小鼠存活率统计

动物实验流程和小鼠存活率结果见图1。CTL组存活率为100%，而ISO组存活率降至65.2%，解剖发现，死亡的小鼠心脏肥大并伴有心脏和肺淤血，说明ISO刺激造成了小鼠心脏衰竭。CAG低、高剂量处理组小鼠存活率分别为85.7%和100%，说明CAG处理可以提高小鼠的存活率，并且这种保护作用呈现剂量依赖性。

2 CAG保护小鼠的心脏功能

对各组小鼠进行超声心动图检测，结果显示，CTL组小鼠的左室射血分数(ejection fraction，EF)和短轴缩短分数(fractional shortening，FS)分别是(70.7±7.4)%和(39.4±6.0)%;ISO组小鼠的EF[(54.4±8.4)%]和FS[(27.8±5.4)%]均明显下降，说明ISO刺激导致小鼠心脏功能紊乱；低、高剂量CAG处理后，与ISO组相比，小鼠的EF[低剂量组：(68.3±6.9)%；高剂量组：(72.1±8.5)%]和FS[低剂量组：(37.8±5.2)]%；高剂量组：(41.1±6.8)%]均明显上升，说明CAG能够缓解ISO造成的心脏功能紊乱，并呈现剂量依赖性;与ISO组相比，DMSO溶媒对照组的各项指标均无显著性差异，说明DMSO对ISO刺激造成的小鼠心脏功能紊乱没有改善作用，见图2。

3 CAG缓解了ISO刺激所致的心肌纤维化

为了探究CAG对心肌纤维化的影响，进行Masson三色染色法检测，结果显示，CTL组小鼠的心脏没有纤维化现象；ISO刺激后心脏间质呈现明显的纤维化，说明小鼠心肌纤维化模型成功；CAG处理后，与ISO组相比心肌纤维化水平均明显下降;而DMSO溶媒对照组无此作用,见图3。对心肌纤维化面积进行定量分析，也说明了CAG处理能够显著降低ISO刺激所致的心肌纤维化，而DMSO对其没有缓解作用，所以下面实验只比较剩余4组的差异。

Figure 2.The effects of CAG on cardiac function. A: representative images of echocardiograms in each group after 5-week treatment procedure; B: quantitative analysis of EF and FS.*P<0.05,**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,##P<0.01vsISO group.

图2 CAG对ISO刺激后小鼠心脏功能的影响

检测肌成纤维细胞标志物α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)发现，与CTL组相比，ISO刺激可显著增加α-SMA的mRNA表达;而CAG高剂量处理后α-SMA的mRNA水平与ISO组相比显著下降；CAG低剂量处理后其转录水平有下降趋势，但差异无统计学显著性，见图3C。以上结果说明CAG处理能够缓解ISO刺激造成的小鼠心肌纤维化，并且呈现剂量依赖性。

Figure 3.The effects of CAG on cardiac fibrosis. A: representative images of heart sections stained by Masson’s trichrome in each group (×20); B: quantitative analysis of fibrotic area in each group; C: the effects of CAG on the mRNA level of α-SMA. Mean±SD.n=3～4.**P<0.01vsCTL group;##P<0.01vsISO group.

图3 CAG对ISO刺激所致心肌纤维化的影响

4 CAG抑制了小鼠心脏组织氧化应激相关因子的转录

我们对小鼠心脏的氧化应激水平进行分析，结果显示，ISO刺激后，小鼠心脏中诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和NADPH氧化酶4(NADPH oxidase 4，NOX4)的mRNA水平与CTL组相比均显著升高，CAG处理后这2种因子的mRNA水平与ISO组相比均显著降低，见图4。这说明CAG处理能够显著降低ISO诱导的氧化应激相关因子的转录，发挥抗氧化的作用。

Figure 4.CAG attenuated ISO-induced oxidative stress in the mouse hearts. A: the mRNA level of iNOS; B: the mRNA level of NOX4. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,#P<0.01vsISO group.

图4 CAG抑制ISO刺激所致小鼠心脏组织氧化应激相关因子的表达

5 CAG抑制了小鼠心脏组织炎症因子的转录和NF-κB信号通路的激活

我们对相关炎症因子和NF-κB信号通路进行分析。RT-qPCR结果显示，ISO刺激后TNF-α和IL-1β的mRNA表达水平与CTL组相比，均显著升高；而CAG处理后，与ISO组相比，低剂量组TNF-α和IL-1β的mRNA水平均显著降低，高剂量组IL-1β的mRNA水平明显降低，而TNF-α无明显差异，见图5A、B。Western blot结果显示，ISO刺激后p-IκBα/IκBα和p-p65/p65与CTL组相比均显著升高；CAG低剂量组p-IκBα/IκBα与ISO组相比显著降低，而p-p65/p65有下降趋势，但差异无统计学显著性；高剂量组p-p65/p65显著下降，但p-IκBα/IκBα下降不显著，见图5C、D。这说明不同剂量的CAG从不同水平调控NF-κB信号通路，缓解炎症反应。

6 CAG抑制了小鼠心脏组织TGF-β的表达和胶原的合成

免疫组织化学结果显示ISO刺激诱导了TGF-β的表达，而CAG处理可以抑制TGF-β的上调，见图6A。Western blot检测也证实了以上结果，见图6B。I型胶原蛋白(collagen type I，Col-I)和III型胶原蛋白(collagen type III,Col-III)是心脏细胞外基质的主要成分。RT-qPCR结果显示ISO刺激导致Col-I和Col-III表达显著升高，而CAG处理可显著抑制两者的转录，见图6C、D。这说明CAG可以通过抑制TGF-β表达和减少胶原蛋白的合成，缓解心肌纤维化。

7 CAG直接影响心脏成纤维细胞中胶原蛋白的合成

用10 μmol/L ISO刺激心脏成纤维细胞，检测不同时间点α-SMA、Col-I、Col-III和TGF-β的转录水平，RT-qPCR结果显示ISO刺激48 h后各因子的mRNA表达均显著升高，因此，我们在1 μmol/L CAG预处理细胞12 h后，用ISO与CAG共刺激48 h。RT-qPCR结果显示CAG处理可以显著抑制ISO刺激所致的α-SMA和Col-I的表达上调，但对Col-III的影响不明显,见图7。这说明CAG能够直接抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞分化，阻碍胶原蛋白合成，缓解心肌纤维化。

8 CAG抑制了心脏成纤维细胞中相关因子的转录

我们检测了心脏成纤维细胞中相关因子的转录水平，RT-qPCR结果显示，CAG能够显著抑制ISO刺激所致的NOX4、TNF-α、IL-1β和TGF-β的mRNA表达，见图8。这说明CAG能够直接调控心脏成纤维细胞的氧化应激和炎症反应。

讨 论

CF是心脏重塑的主要表现之一，治疗CF对于减轻心衰、心律失常等多种心血管疾病均有帮助[12]。目前关于这些心血管疾病的治疗策略主要与肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)和β-肾上腺素受体相关，包括血管紧张素转换酶抑制剂、醛固酮拮抗剂、β-阻滞剂和他汀类药物等[13-16]。虽然这些药物能够部分恢复心脏功能，但却不能减轻CF。我们的研究表明，CAG能够显著改善ISO刺激所致的小鼠心肌纤维化并缓解心脏功能紊乱。

Figure 5.CAG inhibited ISO-induced activation of inflammation in mouse hearts. A and B: the effects of CAG on the mRNA levels of TNF-α and IL-1β; C and D: Western blot analysis was used to determine the protein levels of IκB, p-IκBα, p65 and p-p65. Mean±SD.n= 4～5.*P<0.05,**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,##P<0.01vsISO group.

图5 CAG抑制ISO刺激所致的炎症小鼠心脏组织反应

CF是一个复杂的病理过程，多种信号通路和细胞因子参与其中[12]。临床和实验研究表明，在心脏重塑过程中过量的ROS和紊乱的抗氧化防御系统所致的氧化应激现象明显增强，ROS的主要来源包括NOX、线粒体呼吸链和iNOS[17]。ROS增多刺激肌成纤维细胞大量增殖，并诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)表达，从而导致CF[18]。最近研究表明，NOX来源的ROS在CF的发展过程中发挥着重要作用[19]。此外，炎症因子(如TNF-α)能够激活iNOS，产生大量的NO，过多的NO可直接或与过氧化物一起引起细胞氧化应激，导致心脏组织损伤[20]。根据我们的实验结果可以初步推论，CAG能够抑制NOX4和iNOS的表达发挥抗氧化的作用，防止ROS积累对心脏的损伤。

Figure 6.CAG inhibited ISO-induced expression of TGF-β, Col-I and Col-III in mouse hearts. A: the expression of TGF-β in the mouse hearts was showed by immunohistochemical staining (scale bar=100 μm); B: Western blot analysis was used to determine the expression of TGF-β; C: the effects of CAG on the mRNA levels of Col-I and Col-III. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCTL group;#P<0.05,##P<0.01vsISO group.

图6 CAG抑制ISO刺激所致的小鼠心脏组织TGF-β、Col-I和Col-III表达

在病理性心肌重塑过程中，免疫细胞如巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞均可调节CF进程[21]。免疫细胞产生的炎症因子,如TNF-α和IL-1β，能够诱导心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，后者参与ECM的合成并导致其在心脏中积聚，进一步加重CF[22]。此外，TNF-α还能通过激酶介导的磷酸化反应激活NF-κB信号通路，诱导炎症反应的发生[23]。我们的实验结果表明CAG处理显著抑制了ISO刺激导致的NF-κB信号通路激活，说明其缓解纤维化与抑制炎症反应有关。

TGF-β是在CF发展进程中发挥重要调节作用的促纤维化因子，它能够被ROS、炎症因子等多种因素激活，激活下游的Smad信号通路，促进纤维化发生[24]。此外，TGF-β通过调节MMP的分泌，导致细胞外基质沉积，诱发心脏重塑[25]。我们的实验表明CAG能够降低TGF-β的表达，从而缓解心肌纤维化。

Figure 7.CAG inhibited ISO-induced mRNA expression of collagens in cardiac fibroblasts. A: RT-qPCR was used to detect the mRNA levels of α-SMA, TGF-β, Col-I and Col-III at various time points after ISO stimulation; B～D: the effects of CAG on the mRNA levels of α-SMA, Col-I and Col-III at 48 h after ISO stimulation. Mean±SEM.n=3 .*P<0.05,**P<0.01vsCTL group;##P<0.01vsISO group.

图7 CAG抑制心脏成纤维细胞中胶原蛋白的mRNA表达

Figure 8.CAG attenuated ISO-induced oxidative stress and inflammation in cardiac fibroblasts. A～D: the effects of CAG on the mRNA levels of NOX4, TNF-α, IL-1β and TGF-β. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vsCTL group;##P<0.01vsISO group.

图8 CAG抑制心脏成纤维细胞中氧化应激相关因子、炎症因子和TGF-β的mRNA表达

心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化是CF发生的细胞基础。我们证明了CAG能够抑制心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化，阻止CF的发生。并且CAG能够直接作用心脏成纤维细胞，降低氧化应激水平，抑制炎症反应，缓解纤维化，保护心脏功能。

综上所述，CAG可以通过减轻氧化应激水平、抑制NF-κB信号通路激活和降低TGF-β表达缓解心肌纤维化，进而保护心脏功能。本研究为环黄芪醇在心脏抗纤维化治疗方面的应用提供了初步的研究基础。