荔枝核研究进展及其质量标志物预测分析

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(1.广西中医药大学药学院,广西南宁 530001;2.广西优势中成药与民族药开发工程技术中心,广西南宁 530020;3.中山大学生命科学学院,广东广州 510275)

荔枝属于无患子科荔枝属(Sapindaceae Litchi),荔枝核为无患子科植物荔枝LitchichinensisSonn的干燥成熟种子[1],其树根、花蜜、果实均可入药[2],别名为荔仁、枝核或大荔核[3]。我国荔枝年产量可达两百万吨,且每年有大量荔枝核被用来加工荔枝干、荔枝罐头和荔枝酒[4],在此期间,荔枝核被大量丢弃,人们单一的认为它是副产品,没有利用价值,不仅对环境造成污染,同时也造成了资源的浪费。中医研究表明,荔枝核具有行气散结、理气祛寒、止痛等功效,根据这一特性,荔枝核可用作治疗寒病腹痛、睾丸肿痛、胃痛、妇女气滞血痛等疾病的一味良药[1]。其历史悠久,始载于《本草衍义》[5],在《中华药海》[6]、《中药大辞典》[7]中均有记载,且荔枝被称为“南国四大果品之一”。现有研究证明荔枝核具有降血糖、抗肿瘤、抗病毒、抑制乳腺增生以及抗肝损伤等药理作用[8]。荔枝核药用价值高,因此,对于荔枝核的质量控制标准也需进一步完善。

表1 荔枝核中黄酮类化合物[11-12]Table 1 Flavonoids in Litchi Semen[11-12]

荔枝核成分复杂,但在2015年版《中国药典》中并未规定其质量控制标准,为了完善荔枝核质量标准,增强人们对荔枝核的保护意识,本文简要综述荔枝核近年来的化学成分及药理作用,并在此基础上,进行质量标志物的预测分析,为以后荔枝核的深入研究提供理论依据和参考。

1 荔枝核的主要有效成分

荔枝核中主要有黄酮类、多糖类、甾体类、鞣质类、挥发油和氨基酸等化学成分[9]。

1.1 黄酮类

目前,从荔枝核中分离得到的黄酮类化合物有黄酮醇类和二氢黄酮类。近年来,有学者首次从荔枝核中分离出5-反式香豆酰奎宁酸、3-O-反式香豆酰奎宁酸、山柰酚3-O-(6-O-啡酰基)-β-D-葡萄糖基-(1→ 2)-α-L-鼠李糖-7-O-α-L-鼠李糖苷、顺式对羟基肉桂酸、反式对羟基桂皮酸、falandin B[10]五种黄酮类成分。姜振国[11]采用硅胶柱层析的方法从荔枝核50%乙醇部位分离得到10个单体化合物,其中四个属于黄酮类。董旭喆[12]用70%乙醇提取荔枝核并经过乙酸乙酯萃取之后,分离鉴定出了52种化合物,其中黄酮类有17个。图1为黄酮类化合物结构,表1为已从荔枝核中分离鉴定出的黄酮类化合物。

1.2 多糖类

多糖是由糖苷键结合的糖链,是由多个单糖组成的聚合糖高分子碳水化合物。郭放[13]研究荔枝核经水提醇沉得到的多糖(LSEP),并发现此多糖成分是由(1→4,1→6)连接的Glc组成,侧链由Man及Gal组成,末端由Man构成,其主要由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖等单糖组成,且大孔树脂水洗脱部分主要是鼠李糖,大孔树脂30%乙醇洗脱部分和95%乙醇洗脱部分主要是葡萄糖。钱力[14]通过研究荔枝核多糖提取的最佳工艺,得到在最佳工艺条件下其多糖含量为5.72%。且近几年来对于荔枝核多糖的研究主要集中于提取方法方面的优化[15-16],建议可以采用柱前衍生-高效液相色谱法来分析多糖的单糖组成。

图1 荔枝核黄酮类化合物结构类型Fig.1 Structural types of flavonoids from Litchi Semen

1.3 甾体类化合物

荔枝核中含有的甾体类化合物有皂苷和甾醇两种。徐新亚[17]在荔枝核中首次分离得到五种苷类成分,并对其结构进行鉴定,分别为(-)-松脂素4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、苯乙基β-D-吡喃葡萄糖苷、乙基β-D-吡喃葡萄糖苷、乙基α-D-吡喃葡萄糖苷、胞苷。屠鹏飞[18]等经过不同溶剂萃取,并通过GC-MS分析鉴定出了13种甾醇类化合物,分别是硬脂酸、β-谷甾醇、豆甾醇、(24R)-5α-豆甾烷-3,6-二酮、豆甾烷-22-烯-3,6-二酮、3-羰基甘遂烷-7,24-二烯-21-酸、胡萝卜苷、豆甾醇-β-D-葡萄糖苷、1H-imidazole-4-carboxylic acid,2,3-dihydro-2-oxo,methyl ester、乔松素-7-新橙皮糖苷、D-1-O-甲基-肌-肌醇、半乳糖醇、肌-肌醇。图2为荔枝核中已知的甾体类化合物的结构式。

图2 荔枝核甾体类化合物Fig.2 Nucleosteroids from Litchi Semen

1.4 鞣质类

鞣质又名单宁,是一类能与大分子蛋白质或生物碱结合发生反应并生成沉淀的结构复杂的多元酚类化合物[19],从化学结构上进行分类,可以分为可水解鞣质和缩合鞣质两大类,而水解鞣质则可根据水解的酚酸类化合物的不同,分为鞣花鞣质和没食子酸酯鞣质两大类鞣质。钟世顺[20]采用颜色-沉淀反应对鞣质进行鉴别,采用干酪素法进行含量测定,并以鞣质含量为指标优选出最佳提取方法,进而得出荔枝核鞣质类成分为缩合鞣质。Xu等[21]通过HPLC分离得到八种鞣质类成分,分别是:litchitannin A1、litchitanninA2、aesculitannin A、epicatechin(2β→O→7,4β→8)-epiafzelechin-(4α→8)-epicatechin、原花青素A6、原花青素A1、原花青素A2和epi-catechin-(7,8-bc)-4β-(4-hydroxyphe-nyl)-dihydro-2(3H)-pyranone。且查阅相关文献发现对于鞣质类成分的研究少之又少,建议可以从其含量以及药效活性方面进行研究。

1.5 挥发性成分

荔枝核挥发油的主要化学成分为酯、烯、萘等。徐多多等[22]通过水蒸气蒸馏法提取挥发油,采用GC-MS法对化学成分进行鉴定,最终测出53种挥发性成分。张媛等[23]对荔枝核成分进行GC-MS分析,共鉴定出30种脂溶性成分,其中棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和2-辛基-环丙烷辛酸占脂溶性成分的88.80%。饶长全等[24]采用超临界CO2萃取法,对荔枝核挥发性成分进行GC-MS分析,共鉴定出67种化合物,其中甾醇含量最高。

1.6 氨基酸

荔枝核中含有大量的游离氨基酸,王洋[25]采用离子色谱法测定出了9种氨基酸,分别是精氨酸、赖氨酸、丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸、组氨酸、苯丙胺酸和酪氨酸,其中苏氨酸、精氨酸和甘氨酸占总氨基酸含量的64%。黄雪松等[26]在荔枝核的水、醇提取物中共检出21种游离氨基酸,在王洋的基础上多出了天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、缬氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸和亮氨酸等,其中4个未知,有6种人体必需氨基酸,占总氨基酸的44%。

2 药理作用

近年来研究表明,荔枝核具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎、降血糖、改善糖脂代谢、抑制乳腺增生以及抗肝损伤等药理作用[27]。

2.1 抗肿瘤

荔枝核水提物和醇提物、含药血清以及单体活性成分均具有一定的抑瘤作用,且初步判断其抗肿瘤药效成分为黄酮类和四环二萜类化合物。陈泳晖等[28]发现荔枝核含药血清对小鼠EAC移植性肿瘤、S180移植性肿瘤和肝癌移植性肿瘤均有抑制作用,且抑瘤率分别为31.30%～29.27%、32.53%～29.45%和37.40%～35.11%;同时发现荔枝核颗粒剂的抑瘤率微高于荔枝核水提液。Chung等[29]通过观察荔枝核提取物对A549腺癌细胞和NCI-H661癌细胞EGFR信号传导、细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,发现在细胞实验中,LCSE能有效地减少癌细胞的数量,诱导生长抑制、细胞周期停滞和凋亡死亡。Hsu等[30]研究了荔枝核乙醇提取物(LCSP)对结直肠癌Colo320dm和SW480细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响,结果表明,LCSP能显著诱导大肠癌细胞凋亡,且呈剂量依赖性,抑制了细胞周期。猜测其抑瘤作用原理可能与促进肿瘤细胞凋亡有关,且对肿瘤细胞的生长具有直接的抑制作用。

2.2 抗病毒

近年来,有关荔枝核抗病毒的报道并不少见,包括单纯疱疹病毒、体外抗腺病毒、抗鸭乙肝病毒、流感病毒等多种病原体,且发现其抗病毒功效仅次于夏枯草,并有多数报道指出其抗病毒成分是黄酮类成分,但也有认为是荔枝核皂苷类成分在起作用。猜测可能是由于病原体的不同,起疗效的成分也会有差异。杨艳等[31]研究了荔枝核黄酮类化合物的体外抗腺病毒(Adv)的作用,采用CPE和MTT等方法检测黄酮类化合物作用于Adv不同阶段的抗病毒作用,结果发现其TC50和IC50分别为 116.83,15.46 mg/L,且病毒抑制率最高可达84.31%。推测其抗Adv具体机制可能是通过抑制细胞内某种酶的作用或是通过干扰线粒体功能影响能量合成从而达到抗病毒生物合成的作用。王娟等[32]同样也采用CPE和病毒抑制率确定其体外抗病毒活性,结果发现,黄酮类成分对HSV-1有直接的灭活作用。

2.3 抗炎

核因子-кB(NF-кB)是一种对众多炎症因子的转录具有调控作用的蛋白质分子,而一般在高血糖状态下,炎症因子分泌过多。研究发现,荔枝核有效部位群可抑制大鼠血清中炎症因子的分泌,同时也可抑制大鼠胰腺组织中NF-КB p65蛋白的表达,促进IκBα蛋白的表达,可见,其可能是通过NF-кB通路来抑制炎症的表达[33]。秦楠[34]通过腹腔注射链脲佐菌素制备高脂小鼠模型,然后灌胃荔枝核皂苷来探讨其对炎症因子的影响,发现荔枝核皂苷能够明显抑制血清中炎症因子IL-1β、IL-6的表达,同时抑制了MCP-1和ICAM-1的蛋白表达,这也正是荔枝核抗炎的机制之一。

2.4 改善糖脂代谢

糖脂代谢异常性疾病主要有糖尿病、胰岛素抵抗和高血脂症等,更有学者提出2型糖尿病就是一种慢性炎症疾病,因此抑制了炎症因子的表达就可改善糖脂代谢。也有人猜测其主要是通过调节糖脂代谢过程中酶的活性及表达,以及肠道菌群等来实现的。Li等[35]采用RT-PCR法测定大鼠胰腺组织中GRP78的mRNA和CHOP的mRNA水平,结果发现荔枝核提取物明显改善T2DM大鼠空腹血糖、血清TG水平和耐糖量。也有学者研究了荔枝核干预糖尿病的发病机制,采用代谢组学策略,通过提高胰岛素的mRNA水平降低了胰岛素抵抗指数和尿液中葡萄糖的水平,同时,荔枝核提取物通过增加葡萄糖转运蛋白(Glu)2、glu4、胰岛素受体(IR)和红外底物-2(IRS2)的表达来调节葡萄糖和脂肪酸的代谢[36]。

2.5 抑制乳腺增生

乳腺增生与内分泌失调密切相关,其多表现为雌激素增多、孕激素降低或者雌孕激素比例失调等。Lin等[37]探讨荔枝核皂苷对大鼠乳腺增生的影响及雌激素信号通路的影响,分别测定乳头的直径和高度,检测血清雌二醇(E2)和孕激素(P)含量的变化,结果发现低剂量组和高剂量组的LSE可以使HMG大鼠乳头直径和高度降低,同时使血清E2的含量降低,血清P含量升高,使乳腺增生得到抑制。其机制可能与调节雌激素信号转导途径从而降低雌激素水平有关。同时其还进一步探讨了荔枝核皂苷能显著下调乳腺增生大鼠乳腺组织ERα、细胞外信号调节激酶ERK以及血管内皮生长因子VEGF的表达,从而减弱乳腺增生达到治疗目的[38]。

2.6 改善记忆力

2型糖尿病患者常伴有认知功能低下及学习记忆力降低,Ye等[39]探讨荔枝核水提物对学习记忆障碍模型的改善作用及其机制。通过采用皮下注射d-半乳糖建立学习记忆障碍模型。采用水迷宫试验测定小鼠空间学习记忆能力,检测脑组织中晚期糖基化终产物(AGEs)含量、一氧化氮(NO)和乙酰胆碱(ACh)含量、一氧化氮合酶(NOS)活性和乙酰胆碱酯酶(AChE)活性,结果得到荔枝核水提物能明显改善小鼠学习记忆能力,降低血清AGEs水平,降低脑组织NO含量和NOS活性。其可能与抑制过多的衰老和减少脑细胞损伤有关。Tang等[40]研究了荔枝核提取物(LSE)对认知障碍大鼠T2DM的神经保护、认知功能改善和潜在机制的影响,采用Morris水迷宫法评价了其对大鼠空间学习记忆的改善作用,结果发现,LSE由8种主要成分和20种左右的次要成分组成,对T2DM大鼠具有明显的预防神经元损伤和改善认知功能的作用。其机制可能与其改善胰岛素抵抗,减轻高胰岛素血症所致的海马神经元损伤、血清中β-淀粉样蛋白Aβ沉积及Tau蛋白异常磷酸化有关。

2.7 抗氧化

2.8 抗肝损伤

目前研究认为,酒精性肝损伤发生的机制是酒精导致的氧化应激。Qin等[43]研究了荔枝总黄酮对转化生长因子β1诱导的大鼠肝星状细胞核易位的影响,发现在活化的hsc-t6中,TFL以浓度依赖性的方式抑制了NF-κB的核易位。黄玉影等[44]研究荔枝核有效部位群对非酒精性脂肪肝的治疗作用,结果发现SLEC能显著降低NAFLD大鼠血清TG、LDL-C、NEFA和肝脂质含量,提高血清SOD含量。其作用机制与调节脂质代谢、降低非酒精性脂肪肝水平、改善胰岛素抵抗指数、抗氧化应激和下调肝组织固醇调节元件调节蛋白-1c基因与蛋白表达有关。黄红等[45]通过实验表明TFL可使Smad3、Smad4、TIMP-1蛋白表达明显下降,改善大鼠肝纤维化。

3 荔枝核质量标志物(Q-marker)的预测分析

荔枝作为果品,深受人们喜爱,不仅味美,而且营养十分丰富,含有大量的果糖、维生素、蛋白质、柠檬酸等,对人体有补益作用。研究表明,荔枝核含有丰富的活性物质,且含有大量的淀粉,因此可用来发酵酒精,而且荔枝核含有花青素及酚类物质,可作为降血脂功能食品的良好原材料[46]。所以,从某种程度上讲,荔枝核也属于“药食同源”的产品。为了能够建立科学的质量控制方法,刘昌孝院士提出了“中药质量标志物” 这一概念,它是指:存在于中药材和中药产品中固有的次生代谢物,或加工过程中形成的化学物质;来源于某药物(饮片)特有的而不是来源于其他药材的化学物质;有明确的化学结构和生物活性;可以进行定性鉴别和定量测定的物质;“君”药首选原则,兼顾“臣”、“佐”、“使”药的代表性物质,作为反应中药安全性和有效性的标志性物质[47]。

3.1 基于不同产地成分含量差异的质量标志物Q-marker分析

荔枝属于典型的热带、亚热带水果,在我国主要产自于广西、广东、海南等省。荔枝核中含有多种化学成分,如皂苷类、黄酮类、酚酸类、蒽醌类、挥发油、甾醇、萜类内酯、有机酸及酯、氨基酸肽类、糖类及矿物微量元素等。其中黄酮、皂苷被认为是荔枝核主要有效成分。黄晓兵等[48]对五个产地荔枝核中药饮片黄酮、皂苷、多酚等有效成分含量进行比较研究,发现广东惠东的荔枝核黄酮及多酚含量最高,其次是阳西荔枝核,广西灵山的含量最低。而阳西荔枝核的皂苷含量最高,下来是广东惠东、从化、东莞、广西灵山。因此,从荔枝核中的黄酮、多酚以及皂苷含量的高低来反映出不同产地之间的关系。故可做荔枝核药用植物Q-marker筛选的重要参考。

3.2 基于传统药性的Q-marker预测分析

中药的性能是对中药作用的基本性质和特征的高度概括,是中药基础理论的核心,包括性味归经、升降浮沉、有无毒性等问题。荔枝核味甘、微苦,性温,归肝、胃经,随着临床实践和不断深入,“甘、微苦”不仅是口尝之味,即“甜中带点苦味”,而且代表的是功能之味。严永清等[49]研究了460个常用中药中172个甘味药材,发现甘味药材大多会有糖类、蛋白质和氨基酸,生物碱、苷类和有机酸类次之。根据以上分析,荔枝核中的多糖类成分应是其“甘味”的物质基础。而“苦”味药材大多含有生物碱,萜类和苷类次之。因此萜类成分应是其“苦味”的物质基础,应将其作为荔枝核Q-marker选择的重要依据。

3.3 基于传统功效Q-marker预测分析

荔枝核作为一味传统中药,在《本草纲目》中记载着荔枝核具有行气散瘀、祛寒止疼的功效,可用于治疗代谢紊乱、疝痛、腹痛等症状。在现代药理研究中,荔枝核具有降血糖、抗肿瘤、抗氧化等功效[27]。荔枝核中黄酮类成分如乔松素-7-O-β-D-葡萄糖苷、金粉蕨素、槲皮素以及甾醇类如原儿茶醛、原儿茶酸、胡萝卜苷、β-谷甾醇均具有降血糖的功效[50],且黄酮类成分还具有抗肿瘤和抗病毒的功效[51]。这些化学成分发挥的作用与荔枝核传统功效相对应,是荔枝核传统功效重要的物质基础,可以作为荔枝核质量标准筛选的重要依据。

3.4 基于中药配伍环境的Q-marker预测分析

配伍是中药运用的主要形式,是按一定的原则将两种以上的药物配合在一起使用,是为了协调药物偏性、增强药物疗效以及减轻毒副作用,并且同一位味药材在不同配伍中有着不同的药效基础。

3.4.1 药对配伍 药对配伍就是两味药(个别为三味药)成对使用,是临床上常用的相对固定的配伍形式,也是中药配伍运用的最小单位。《中药药对大全》[52]中记载:“荔枝核-橘核”配伍,荔枝核甘温,散寒邪作用较强,兼能快脾气,益肝血。橘核温化散结。二药皆性温入肝经,均能散滞、消疝、止痛。然而荔枝核偏入血分,橘核偏入气分。二药配伍,相须为用,行气散寒止痛之功大增。临床上常用于治疗小肠疝气、气滞淋痛。小茴香-荔枝核配伍用于治疗妇女慢性附件炎、慢性盆腔炎。

3.4.2 复方配伍 中药复方是中药临床应用的主要形式。如荔枝核、土鳖虫、鳖甲、莪术、赤芍、丹参、乌药、水蛭、甘草等十味中药配伍得到荔枝方,具有益气滋阴、活血祛瘀的功效,治疗子宫肌瘤具有很好的效果[53]。陈广辉等[54]运用荔枝核配伍淫羊藿、熟地黄、紫河车、黄精、沙苑子、黄芪、当归等制成养精汤,具有温阳益精、益气养血、活血通络的功效,用于治疗精子异常导致的不育症。

3.4.3 经典方配伍 经典方源于古代,沿用至今。如荔核散出自《世医得效方》[55],由荔枝核、沉香、木香、八角茴香、小茴香、川楝子肉六味中药配伍组成,具有行气散结、祛寒止痛的功效。用于寒凝气滞之疝气,阴核肿大等症。而出自于《妇人良方》[56]中的蠲痛散,是由荔枝核、香附子两味中药配伍而成,用于治疗妇人血气刺痛,室女月经不通。

中药配伍之后一般有着多方面的疗效,而在临床应用中,对于不同的病症应采用不同的配伍治疗。因此,荔枝核质量标志物的筛选应联系到其临床应用,对综合药效的有效物质群进行考虑。

3.5 基于新的药效用途的Q-marker预测分析

目前,荔枝核总黄酮大多在肝纤维化、乙型肝炎病毒方面具有治疗作用,但是荔枝核在现代临床应用中,也用于治疗肾纤维化疾病,猜测其可能使肾病大鼠纤维黏连蛋白和Ⅵ型胶原蛋白的表达有关。刘淼等[57]证实了荔枝核总黄酮可以使FN、Col Ⅵ蛋白的表达下降,从而产生抗肾纤维化作用。因此,应将黄酮类化合物作为荔枝核Q-marker的重要参考依据。

3.6 基于化学成分的可测性Q-marker预测分析

化学成分的可测性是Q-marker确定的另一个重要依据,目前中药化学成分主要通过色谱来进行测定[58],荔枝核的Q-marker在色谱上进行定性鉴别和定量测定,便于建立质量评价方法,制定科学可行的质量标准。

根据以上分析,黄酮类、多糖类、甾体皂苷类、鞣质类和萜类等成分是荔枝核Q-marker的重要选择。多糖类成分复杂,由众多单糖组成,分子量大,其活性部位不明确,而且含量很难直接测定,目前多采用紫外可见光度计进行多糖含量的测定,若采用高效液相色谱法测定则应将多糖将降解为单糖,而黄酮类、甾体皂苷、萜类等操作简便,可直接采用色谱法进行测定。有学者对荔枝核化学成分进行了研究,如甾体皂苷类的β-谷甾醇和原儿茶酸[59-60],萜类化合物的芍药苷等[53],而对于荔枝核中较难分离成含量较低的成分,则应采取新的检测方法。

3.7 基于可入血化学成分的Q-marker预测分析

中药有效性的控制是质量控制的基础,虽然中药化学成分的组成十分复杂,但化学成分必须吸收入血并达到一定的血药浓度才可以在体内产生一系列药理作用或发挥疗效。通过分析给药原型成分及其代谢产物,基于化合物-靶点-通路对其显效方式进行探讨,筛选出荔枝核药效成分。钟世顺等[61]研究荔枝核皂苷在调节糖调节受损大鼠血流动力学及血脂谱,改善其代谢紊乱及缺氧状态,并测定了豆甾醇、对羟基苯甲醛、胡萝卜苷和山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷等属于荔枝核的原型成分,可将此类化合物作为筛选荔枝核Q-marker的重要依据。

4 结论

我国是荔枝栽培最早的国家,随着其加工的迅速发展,荔枝核等副产品必然会大大增加,再者其属于传统中药,所以今后对荔枝核的再利用也将成为研究的焦点。我国中药种类繁多、成分复杂,但现行的质量标准中并未对特定药材实行“针对性”或“专属性”的质量评价方法,从而无法反映不同药材之间的“特异性”。随着现代科学技术的日益成熟,中药Q-marker的研究思路和参照方法也越来越完善。对荔枝核的质量进行全面、准确地评价有利于荔枝核产业的健康发展。

本文在对荔枝核化学成分和药理作用综述的基础上,结合Q-marker概念,根据其不同产地间的关系、临床新用途、可测成分、药性和药效、入血成分和配伍环境对Q-marker的筛选进行了预测。后期,本课题组还将对荔枝核Q-marker的预测进行深入的研究,以便完善荔枝核的质量标准。同时,将废弃的荔枝核变废为宝,让人们体会到其价值,不仅可以合理的利用资源且不被浪费,所以荔枝副产品的深加工将具有很大的社会意义。