高压脉冲电场辅助水酶法提取杜仲叶中不可萃取多酚

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(1.湖南农业大学食品科学技术学院,湖南长沙 410128;2.慈利县九九农业开发有限公司,湖南张家界 427200)

杜仲属于单科、单属、单种的落叶乔木,是我国特有的经济植物,传统以杜仲皮入药,为我国名贵中药材,在我国许多经典药学著作中均有记载,而杜仲树剥皮后容易死亡,制约了杜仲的药用价值。研究发现,杜仲叶属于可再生资源,并且与杜仲皮化学成分相似[1],叶中多酚类物质的含量高于皮[2],具有补肝益肾、强筋健骨、抗氧化[3]、降血压[4-5]、降血脂等功效[6]。

高压脉冲电场提取是将液态样品或液体浸泡的固态样品作为电解质置于容器内,通过放电产生高压电流,破坏植物细胞,改变其通透性,使细胞内的物质能够有效流出的一种食品加工方法[7-8]。高压脉冲电场在食品加工领域应用广泛,主要包括物料干燥[9]、食品杀菌[10]、辅助提取活性成分[11]等。Boussetta等[12]用高压脉冲电场辅助提取葡萄渣中的多酚,结果表明,高压脉冲电场辅助提取的多酚提取率比对照组高30%。Kantar等[13]等发现利用高压脉冲电场辅助柑橘、柚子和柠檬榨汁会使果汁中多酚含量增加了大约39%、66%和135%。也有研究表明,高压脉冲电场与水酶提取结合,多酚含量从0.5 mg/g提高到4.3 mg/g[14]。脉冲电场虽然可以提高多酚含量,但是对于提高多酚含量的影响因素方面研究不足。

多酚是杜仲叶主要活性成分[15]之一,具有抗氧化、抗衰老、杀菌、抗肿瘤癌变、抗心血管疾病等作用[16-20]。植物总多酚分为可萃取多酚与不可萃取多酚两部分。可萃取多酚通过简单的有机相萃取即可获得,而不可萃取多酚需要通过化学或酶法破坏细胞壁才能分离[21]。有研究表明,不可萃取多酚的含量高于可萃取多酚[22],在食品营养方面具有广阔的应用前景。但目前国内对于不可萃取多酚提取工艺的研究较少。

因此本实验利用高压脉冲电场辅助水酶法提取杜仲叶中不可萃取多酚,响应面优化提取工艺,为未来杜仲叶开发利用提供理论依据及研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

华仲8号杜仲叶 采自湖南省慈利县九九农业开发有限公司,将杜仲叶清洗后于-80 ℃冰箱下预冷,然后进行冷冻干燥,将干燥好的杜仲叶用中药粉碎机粉碎,过60目筛,密封放-20 ℃冰箱保存待用;没食子酸(纯度≥99%) 成都瑞芬思生物科技有限公司;纤维素酶(400 U/mg) 上海瑞永生物科技有限公司;水 为超纯水;丙酮、乙酸乙酯、甲醇 分析纯,国药集团;其他试剂 均为分析纯。

高压脉冲电场 实验室自制;GO-酶标仪 Thermo Fisher Scientific公司;DTY-A220型电子天平 美国康州HZ电子科技有限公司;TF-FD-1L型冷冻干燥机 上海拓纷机械设备有限公司;KM-300DE型中文液晶超声波清洗器 昆山美美超声仪器有限公司;LH-08B型中药粉碎机 浙江省温岭市创力药材器械厂;RE-2000B型旋转蒸发仪 巩义市中天科技仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 杜仲叶不可萃取多酚的提取 取保存于-20 ℃的杜仲叶粉末,加入85%丙酮(料液比=1∶10 g/mL)搅拌均匀,涡旋30 s,30 ℃下240 W超声30 min,取出后抽滤分离上清液和残渣,残渣分别用甲醇、水各洗3次,冻干后作为提取不可萃取多酚原料。取1 g冻干粉末加入8 mL的蒸馏水及一定量的纤维素酶,使用高压脉冲电场进行提取,抽滤得上清液,即为杜仲叶不可萃取多酚提取液。

1.2.2 不可萃取多酚含量的测定 参考Sun等[23]的方法并稍作修改。称取5 mg没食子酸于50 mL容量瓶中,再分别取0、1、2、3、4、5 mL于10 mL容量瓶中,蒸馏水定容,得0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL没食子酸标准品。取50 μL不同浓度的没食子酸标准品于96孔板中,加入50 μL福林酚试剂,中速振荡1 min,避光反应10 min后加入125 μL 7.5%的碳酸钠,中速振荡1 min,避光反应1.5 h后,置于酶标仪板槽内,在765 nm处测量吸光度。以浓度为横坐标,吸光度 为纵坐标,绘制标准曲线。曲线方程为:Y=16.439X+0.028,R2=0.9991。杜仲叶中不可萃取多酚含量的计算公式为:

不可萃取多酚含量(mg/g)=(C×V)/D

式中:C为标准方程计算出的浓度,mg/mL;V为提取液体积,mL;D为杜仲叶残渣质量,g。

1.2.3 单因素实验设计 取0.1 g左右的杜仲叶残渣,以水为提取溶剂,固定单因素水平为:酶用量为12 mg、场强为2.81 kV/cm、脉冲数为100次,考察不同的酶用量(10、12、14、16、18 mg)、场强(2.21、2.51、2.81、3.11、3.41 kV/cm)、脉数(20、40、60、80、100次)对杜仲叶不可萃取多酚提取效果的影响。场强设置在2.21～3.41 kV/cm之间是因为在此区间内不可萃取多酚提取率变化较为明显,继续增大场强会导致电压不稳,实验结果不准确。

1.2.4 响应面试验设计 根据Box-Behnken试验设计原理[24],在单因素实验的基础上,以酶用量(A)、场强(B)、脉冲数(C)为考察因素,杜仲叶不可萃取多酚含量为响应值,采用三因素三水平的响应面试验设计,响应面试验的因素水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factors and levels in response surface design

1.3 数据处理

每组实验3次平行。通过OriginPro 8.5整理数据,绘制图片,并采用Design-Expert 10统计软件进行响应面优化分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 酶用量对不可萃取多酚提取效果的影响 由图1可知,不可萃取多酚的含量随着酶用量的增加呈现出先上升、后下降的趋势,当酶用量为16 mg时达到最大值,为31.38 mg/g。这是因为纤维素酶的增加会破坏杜仲叶细胞壁,增强膜的渗透性,利于多酚类物质溶出,但是过多的纤维素酶就会产生粘附性,阻塞多酚物质溶出通道,同时酶量饱和时,酶解反应较为完全,继续增大酶量会产生抑制作用[25-26]。

图1 酶用量对不可萃取多酚含量的影响Fig.1 Effect of enzyme dosage on thecontent of non-extractable polyphenols

2.1.2 场强对不可萃取多酚提取效果的影响 场强与细胞膜的通透性密切相关,当场强增大时,使细胞膜两侧形成电位差,从而导致磷脂双分子层发生位移,使细胞结构紊乱,提高细胞通透性,有利于溶剂进入细胞,同时胞内物质释放能力增强[27]。从图2中可以看出,随着场强的增大,不可萃取多酚的含量逐渐上升,当场强为3.41 kV/cm时,含量为29.51 mg/g,由于实验仪器限制,继续增大场强会导致电压不稳,所以场强最大为3.41 kV/cm。

图2 场强对不可萃取多酚含量的影响Fig.2 Effect of field strength on thecontent of non-extractable polyphenols

2.1.3 脉冲数对不可萃取多酚提取效果的影响 由图3可知,不可萃取多酚含量随着脉冲数的增加呈现先增大后降低的趋势。当脉冲数为80次时,含量最高为18.49 mg/g,小于80次时,脉冲数过小,对细胞的破坏的程度较低,不利于多酚物质的溶出;增大脉冲数,电场的作用频率增强,同时增强细胞的破坏程度及破坏细胞数量,但脉冲数过大,时间过长,会产生不稳定因素,破坏多酚物质结构,从而降低了不可萃取多酚的含量[28]。

图3 脉冲数对不可萃取多酚含量的影响Fig.3 Effect of pulse number on thecontent of non-extractable polyphenols

2.2 响应面优化不可萃取多酚的提取工艺

2.2.1 响应面试验设计及结果 为优化高压脉冲电场结合水酶提取杜仲叶中不可萃取多酚的工艺条件,采用三因素三水平Box-Behnken试验设计,在单因素实验基础上,精密称取0.1 g左右的杜仲叶残渣于比色管中,按照表1的因素水平对杜仲叶不可萃取多酚的提取工艺进行优化。具体方案及结果见表2。

表2 响应面试验方案及结果Table 2 Scheme and experimental resultsof response surface design

2.2.2 模型评价 利用Design-Expert软件对表2试验数据进行二次多项式回归拟合,得到的数学模型为:

Y=22.2+3.44A-1.9B+2.27C-1.05AB+1.36AC+0.7BC+2.06A2+1.13B2+0.27C2

模型方差分析结果和各项系数显著性检验结果列于表3。

2.2.3 响应面分析 由图4可知,当酶用量和脉冲数,场强和脉冲数的响应面图曲面走势陡峭,响应值的改变较为敏感,同时等高线呈椭圆形且曲线密集,这说明酶用量与脉冲数,场强与脉冲数的交互作用对不可萃取多酚的含量有显著性影响。而酶用量和场强交互作用的响应面图曲面较为平缓,响应值改变不敏感,等高线不密集,这说明不可萃取多酚的含量受两者交互作用影响的变化程度较小。通过最优化分析,最佳的提取条件为酶用量18 mg,场强2.81 kV/cm,脉冲数100次,预测值为34.969 mg/g。

表3 回归模型各项方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

表4 平行试验结果Table 4 Parallel test results

图4 各两因素的响应面和等高线图Fig.4 Response surface and contour map of each two factors

2.2.4 试验结果验证 在最优条件下进行3次平行试验,测得杜仲叶不可萃取多酚的含量为(34.961±0.052) mg/g,与预测值34.969 mg/g相比,相差0.008 mg/g,说明此方程与实际情况拟合良好,建立的模型可靠。

3 结论

为了充分发挥杜仲叶的药用价值,本文采用高压脉冲电场辅助水酶法提取杜仲叶残渣中不可萃取多酚,对杜仲叶不可萃取多酚方面的研究进行补充。研究得出,高压脉冲电场辅助水酶法提取杜仲叶中不可萃取多酚的最佳提取工艺为:酶用量18 mg,场强2.81 kV/cm,脉冲数100次,在此条件下,不可萃取多酚的含量为(34.961±0.052) mg/g。目前,关于杜仲叶不可萃取多酚提取的研究较少,不可萃取多酚具有多种生物活性价值,对杜仲叶残渣进行提取有极大地利用了杜仲叶,避免杜仲叶资源的浪费。对于不可萃取多酚的提取,应用较多的方法为酸水解方法和碱水解法,酸碱提取法存在耗时长、酸碱污染等、资源浪费等不足,而本文采用的高压脉冲电场是一种新型提取技术,具有能耗小、耗时短、效率高、无污染等优势,最重要的是能极大地保留原料中含有的化学成分。本文对于杜仲叶不可萃取多酚的研究尚存在一些不足,包括化学成分及抗氧化、抗癌、抑菌等生物活性等,接下来将会研究补充。