基于稳定同位素与稀土元素指纹特征的 大桃产地判别分析

李 安，陈秋生，赵 杰，潘立刚,，张 强，靳欣欣，张少军，钱 训

（1.北京农业质量标准与检测技术研究中心，北京 100097；2.天津市农业质量标准与检测技术研究所，天津 300381；3.河北省农林科学院农产品质量安全研究中心，河北 石家庄 050051）

近年来，国家大力实施品牌兴农、质量强农战略，一大批具有鲜明地域特色的名优产品被认定为国家地理标志产品，有效地推进了农业生产的标准化、产品品牌价值的提升和产业集群发展，对区域经济的发展贡献度不断加大。以平谷大桃为例，自2006年实施地理标志产品保护以来，逐渐成为北京市平谷区水果种植的龙头和支柱产业（占全部果品产值达80%）[1]。对食品的原产地进行认证和追溯是欧盟、美国、日本、新西兰等许多发达国家的通行做法[2-3]，通过食品产地追溯体系的建设，一方面为原产地标识的保护提供技术支撑，另一方面也是实施“从农田到餐桌”安全全程控制的必要手段。因此，研发可靠有效的产地判别技术，成为构建产地追溯体系、保护地理标志产品、落实食品标签法规和保障食品安全的迫切需求。

稳定同位素指纹分析技术是食品产地溯源与确证领域最具应用前景的技术之一。由于生物体的稳定同位素组成与气候条件和地理环境密切相关，蕴含了丰富的产地环境信息，因此成为产地鉴别的关键溯源因子。国内外学者利用稳定同位素指纹分析技术，已开展了苹果、梨、枣、橙汁、葡萄酒等水果及水果制品的产地溯源研究。Tanja等[4]比较了意大利4 个产区4 个品种苹果δ13C、δ15N比值差异，指出地域因素对苹果C、N同位素组成的影响明显大于品种因素，利用C、N同位素组合可区分一定空间尺度差异的苹果。王红云等[5]对河北省太行山区赞皇、行唐、阜平3 县大枣果肉中的δ13C和δ15N进行了分析，构建了太行山中麓大枣果肉中同位素组成的区域分布图谱。Schipilliti等[6]利用单体同位素分析技术研究了意大利不同产地的柠檬精油中C同位素组成，结果表明δ13C可有效区分不同产地的精油。吴浩等[7]利用5 种挥发性组分的单体C同位素比值有效区分了中国、法国、美国和澳大利亚4 个产地的葡萄酒。早期学者们对C、N同位素比较关注，近年研究发现H、O同位素也是区分食品原产地的有效指标。Rummel等[8]利用δ2H和87Sr含量组成的二维图谱有效区分了西班牙与美洲国家的橙汁。Bat等[9]利用糖分δ13C、蛋白质δ13C和δ15N、果汁水分δ2H和δ18O和8 种元素（P、S、Cl、K、Ca、Mn、Zn和Rb）等指标建立的线性判别模型成功区分了斯洛文尼亚国内4 个区域的苹果，其中第1个判别函数对分类模型的解释能力达89.7%，果汁水分δ2H和δ18O是主要的贡献因子。黄岛平等[10]分析比较了4 个省份的柑橘果汁δ2H值，结果表明不同地域的柑橘果汁中H同位素组成具有极显著差异，δ2H值总体呈现随着地理纬度增加而减小的趋势。

稀土元素是元素周期表中15 种镧系元素、钪元素和钇元素的总称。稀土元素以不同形态广泛分布于土壤中，通常主要以难溶残渣态形式存在，但也存在可被植物吸收利用的水溶态、可交换态和有机态[11]。植源性农产品中稀土元素来源与地域环境具有一定的关联性，近年来国内外学者对利用稀土元素作为产地溯源指标的可行性进行了探究。林昕等[12]研究了基于15 种稀土元素的指纹特征对云南普洱茶产地判别的有效性，结果表明La、Ce、Eu和Sc是有效的判别指标，对普洱古树茶的产地判别准确率达到94.4%。唐偲雨等[13]利用包含稀土元素在内的32 种矿质元素指纹建立了不同产地的22 个茶叶样品主成分分类模型时发现，稀土元素Y、Pr、Nd、Eu、Gd、Tb、Dy、Ho、Er和微量元素Fe起到主要贡献作用。Bandoniene等[14]通过对包含稀土元素在内的多种矿物元素的测定，利用多元判别分析方法成功将来自澳大利亚、中国和俄罗斯的南瓜籽油进行了区分。Santos等[15]对南美地区2 种外观非常相近的特色水果，即埃塔棕果和阿萨依果中的稀土元素进行了分析，发现Sm、Tb、La、Pr、Gd、Ce和Nd等稀土元素在2 种水果中的差异十分明显，可应用于2 种水果的区分以及产地的鉴别。Farmaki等[16]利用希腊4 个不同地区橄榄油中的10 种稀土元素含量分布数据建立了线性判别模型，模型预测准确为73%。

通常利用单一技术难以实现农产品产地的准确判别，尤其是针对小空间尺度的产品产地区分难度较大，采用多技术、多指标联合进行产地的精确溯源是当前的发展趋势[17]。本研究拟利用稳定同位素联合稀土元素指纹分析技术，建立华北地区小空间尺度下的普通大桃产地溯源模型，以期为大桃产地溯源检测技术体系的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

稳定同位素标准物质USGS40（δ13CVPDB-LSVEC= -26.39‰，δ15NAIR=-4.52‰）、USGS45（δ2HVSMOW= -1 0.3‰，δ18OVSMOW=-2.2 3 8‰）、U S G S 4 6（δ2HVSMOW=-235.8‰，δ18OVSMOW=-29.8‰）和USGS47（δ2HVSMOW=-150.2‰，δ18OVSMOW=-19.80‰）均为美国地质勘探局Reston稳定同位素实验室研制。

稀土元素测定标准物质GBW10019（生物成分分析标准物质——苹果）为中国地质科学院地球物理地球化学勘查研究所研制。

1.2 仪器与设备

MAT253稳定同位素比值质谱仪、Flash 2000HT元素分析仪 美国赛默飞世尔公司；GM200研磨仪 德国莱驰公司；XP6微量天平 瑞士梅特勒-托利多公司；SCIENTZ-18N冷冻干燥机 宁波新芝生物科技股份有限公司；LI-2000全自动真空冷凝抽提系统 北京理加联合科技有限公司；7900电感耦合等离子体质谱（inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS）仪 美国安捷伦公司。

1.3 方法

1.3.1 样品采集

2 0 1 8 年7 ～8 月在北京和河北桃主产区采集样品，样品数量依次为：河北省乐亭县2 0 个（经度范围11 8°4 8′3 4′′～11 8°5 9′8′′，纬度范围39°19′50′′～39°30′40′′）、河北省顺平县15 个（经度范围115°3′9′′～115°8′41′′，纬度范围38°54′10′′～38°58′56′′）、河北省永清县13 个（经度范围116°34′17′′～116°36′4′′，纬度范围39°11′54′′～39°28′26′′）、北京市平谷区44 个（经度范围117°0′54′′～117°16′9′′，纬度范围40°8′47′′～40°16′33′′），其中平谷大桃和顺平桃为地理标志产品。样品均为普通大桃，品种包括久保、绿化九、大红桃等当地主栽品种。4 个产地的地理气候环境具有一定程度的差异，纬度值从大到小依次为平谷区＞乐亭县＞永清县＞顺平县；平谷区和顺平县为半山区丘陵地形，平均海拔高于永清县和乐亭县；乐亭县为滨海地区，具有典型的滨海半湿润大陆性季风气候特征。

1.3.2 样品前处理

样品采集后，去除果柄、果核，并用洁净干纱布擦去果皮表面的灰尘和土壤，利用研磨仪将样品研碎后分装成3 份，分别用于冷冻干燥、水分提取和样品消解。

冷冻干燥：取适量带皮研碎后的桃果浆样品进行预冻处理后，置于冷冻干燥机的样品室中，在-40 ℃、50 Pa条件下进行真空冷冻干燥48 h，冻干后立即取出过100 目筛，将粉末样品置于干燥器中保存，待测。

水分提取：取2 g左右的研碎样品于玻璃样品瓶中，利用全自动真空冷凝抽提系统进行水分提取，将提取出的水分转移至进样小瓶中密封保存，待测。

样品消解：称取5 g（精确到0.001 g）鲜样于50 mL微波消解罐中，加入8 mL硝酸，加盖放置过夜，装入消解外罐，放入微波消解炉转盘上，消解条件主要参考GB 5009.268—2016《食品中多元素的测定》[18]，具体如 表1所示。消解结束后取出消解罐，缓慢打开罐盖进行排气，将消解罐放在控温电热板上，于100 ℃加热30 min，用水定容至25 mL，待测。试剂空白和国家标准物质GBW10019按上述方法同时进行分析。

表 1 微波消解条件Table 1 Conditions of microwave digestion

1.3.3 稳定同位素比值测定

C、N稳定同位素比值的测定：称取约0.8 mg待测样品，用锡杯包好后置于元素分析仪自动进样盘中，样品在960 ℃高温燃烧，并在Cr2O3的作用下氧化成CO2和氮氧化物，氮氧化物经铜还原成N2，即样品中的C和N元素转化成CO2和N2，并在氦载气流和色谱柱吸附解吸后，N2和CO2先后进入稳定同位素质谱仪进行同位素比值的测定。以USGS40为标准物质，采用单点校正的方式对测试结果进行校正。

H、O稳定同位素比值的测定：将提取的样品水分置于元素分析仪的自动进样盘中，样品在1 400 ℃、玻璃碳珠催化作用下裂解为H2和CO，即样品中的H和O元素转化成H2和CO气体，在氦载气流和色谱柱吸附解吸后，H2和CO先后进入稳定同位素质谱仪进行同位素比值的测定。以USGS45、USGS46和USGS47为标准物质，采用3 点校正的方式对测试结果进行校正。

元素分析-稳定同位素质谱（elemental analysisisotope ratio mass spectrometry，EA-IRMS）仪的具体参数：氦气载气流速100 mL/min，氦气吹扫气流速100 mL/min，C、N燃烧炉温度960 ℃，H、O裂解炉温度1 400 ℃。

稳定同位素比值按下式计算：

式中：R样品为测试样品中重同位素与轻同位素丰度比值，即13C/12C、15N/14N、18O/16O、2H/1H；R标准为国际标准样的重同位素与轻同位素丰度比值，其中δ13C以国际标准V-PDB为基准，δ15N以大气为参照标准，δ2H和δ18O以平均海洋水为基准。

1.3.4 稀土元素含量测定

桃样品中16 种稀土元素（La、Gd、Sm、Ce、Nd、Pr、Eu、Sc、Y、Yb、Tb、Ho、Dy、Tm、Er、Lu）含量由ICP-MS测定。工作参数：射频功率1 550 W，冷却气流速15.0 L/min，辅助气流速0.90 L/min，雾化器流速 1.16 L/min，采样高度8.0 mm，泵稳定时间180 s。内标溶液为Agilent 5188-6525；仪器调谐贮备液为Agilent 5184-3566。

1.4 数据处理

应用SPSS 22.0软件对不同产地的大桃样品4 种稳定同位素比值和16 种稀土元素含量进行及多重比较分析和差异显著性检验。应用SPSS 22.0软件对4 个产地的大桃样品进行一般判别分析。

2 结果与分析

2.1 大桃C、N、H、O稳定同位素比值差异分析

利用EA-IRMS测定来自北京和河北4 个不同县区产地的大桃样品C、N、H、O稳定同位素比值，即δ13C、δ15N、δ2H和δ18O。如图1所示，不同产区的桃稳定同位素组成表现出一定的地域差异性。桃树为典型的C3植物，其果实δ13C值分布范围为-29.168‰～-25.061‰。平谷区和顺平县同属山区，地理及气候环境有相似之处，2 个产地的δ13C值总体上低于其他产地。乐亭县的δ13C值显著高于其他3 个产地（P＜0.05），原因可能是乐亭地区属滨海半湿润大陆性季风气候，与其他3 个产地明显不同。农作物样品的δ15N值与施肥类型密切相关，施用有机肥的农作物样品中δ15N值明显高于施用无机化肥样品。相较地域因素的影响，施肥因素导致δ15N值差异的影响程度要大，由图1可知，平谷大桃的δ15N值显著高于其他产区（P＜0.05），乐亭、顺平、永清3 个产区大桃的δ15N值差异不显著（P＞0.05），由此说明，平谷地区的大桃总体上施用有机肥比例较高。植物样品中H、O稳定同位素组成主要受其水源的H、O稳定同位素组成的影响，全球水同位素监测数据显示，大气降水的δ2H和δ18O值随着海拔的增加而减小，地表水和地下水也呈相同的分布规律[19]。 桃树的水源主要来源大气降水和地下水灌溉，研究发现乐亭县大桃产区（海拔1～15 m）的δ2H值显著高于平谷（海拔20～1234 m）和顺平（海拔33～1 006.7 m）地区。乐亭县大桃产区δ18O 值显著高于顺平地区 （P＜0.05），但与永清地区差异不显著（P＞0.05），可能是由于乐亭所处地势相对较低，加之临近海洋，因此δ2H值和δ18O值处在相对较高的水平，与大气降水的氢氧同位素分布特征相吻合（图1），而永清县海拔也较低，因此差异不明显。

图 1 4 个大桃产地C、N、H、O稳定同位素比值箱线图Fig. 1 Box-plots of stable carbon, nitrogen, hydrogen and oxygen isotope ratios in peaches from four producing areas

2.2 大桃稀土元素含量差异分析

如表2所示，根据实验测定结果，鲜桃肉中Ce、La、Y、Nd 4 种轻稀土元素在果肉中分布较其他稀土元素较为丰富，桃果中轻稀土元素富集、重稀土元素亏缺的特征，与曾江萍等[20]的研究结论一致。利用ANOVA单因素方差分析比较不同产地稀土元素含量差异显著性，结果表明：除Ce和Er外，顺平县15 种稀土元素与乐亭县的稀土元素含量无显著差异（P＞0.05）。平谷区与永清县相比，Ce、Eu、Gd稀土元素具有显著差异（P＜0.05），其余稀土元素的含量均无显著性差异（P＞0.05）。

表 2 大桃果实中16 种稀土元素含量分布情况Table 2 Distribution profiles of 16 rare earth elements in peaches

2.3 基于Fisher判别分析的大桃产地区分模型

基于Fisher判别函数的一般判别方法对大桃样品进行多变量判别分析，以4 种稳定同位素指标（δ13C、δ15N、δ2H和δ18O）和8 种地域分布差异较为明显的稀土元素指标（Y、Ce、Eu、Sm、Pr、Nd、Gd和Er）作为判别分析的自变量，建立大桃产地的判别模型，如下：

提取模型前3 个典型判别函数，Wilks’ Lambda检验结果进一步证实，在α＝0.05的显著性水平下，3 个函数对分类效果均为显著，表明判别模型拟合率可接受，其中判别函数1和判别函数2累计解释判别模型能力为94.7%，且相关系数均大于0.9，表明判别函数1和判别函数2对4 个大桃产地分类占主要贡献作用，利用判别函 数1和判别函数2的得分值作散点图。由图2可知，顺平大桃能明显与其他产地的桃区分开来，这也与顺平县有山区和内陆特殊的气候环境和土壤条件，尤其是顺平县与其他产区的空间距离较远，因此利用稳定同位素和稀土元素相对容易区分；从图2可以看出，平谷、永清和乐亭大桃的组重心距离比较接近。永清大桃与平谷和乐亭的样本均出现重叠现象。

图 2 不同产地大桃前2 个典型判别函数得分散点图Fig. 2 Scattering points of the first two typical discriminant functions for peaches from different geographical origins

利用所建立的判别模型对4 个产地的大桃样品进行归类，并结合留一交叉检验法对所建模型的有效性进行验证。由表3可知，不同产地大桃样本的回代检验的整体正确判别率达97.8%。回代检验是针对所有训练样本进行的检验，因此样本的错判率是相应总体率的偏低估计，而留一交叉检验比较真实地体现了模型的判别能力，本研究建立的判别模型交叉检验的整体正确判别率为95.7%。顺平大桃和乐亭大桃的判别效果最佳，回代和交叉检验的正确判别率均为100%，平谷大桃的交叉检验中有1 个样品被误判为乐亭桃；永清桃的交叉检验中分别各有1 个和2 个样品被误判为乐亭桃和平谷桃。

表 3 不同产地大桃的一般判别分析结果Table 3 General discriminant analysis of peaches from different geographical origins

3 讨 论

由于不同元素的同位素丰度受环境和生物代谢类型影响程度不同，因此各元素的溯源能力不同。前人研究发现，C同位素组成首先取决于植物光合途径（C3、C4、CAM），并受气候环境因子（温湿度、降雨）与自身生理因素（气孔导度、胞间CO2浓度）相互作用的影响[21]；N同位素组成则主要与植物固氮类型和生长时所用的肥料类型有关[22]，化学合成氮肥中的氮素直接来源于空气中的N2，工业生产过程中氮稳定同位素基本不发生分馏，氮肥的δ15N在-2‰～2‰之间，而有机肥（如堆肥、粪肥和鱼粉等）等有机物质由于本身原料中的δ15N值较高，加之在堆沃、发酵等生产过程中更加富集15N，因此δ15N值相对较高，其中动物粪便肥一般在3.5‰～16.2‰之间[23-24]。 H、O同位素组成则体现了降雨、地表水、地下水等各种水源的混合水分稳定同位素组成特征及其对应的气候环境条件[21]。本研究涉及的4 个产地大桃判别指标中，N同位素的判别能力显著高于C、H、O同位素，尤其是平谷区桃的15N水平明显比其他3 个产地富集，表明在小空间尺度下的桃样本，种植因素的地区差异要比气候环境因素明显。C、H、O同位素组成均受气候因子的影响，但对于本研究涉及的小空间尺度样本，仅乐亭县的H、O同位素组成与其他3 个产地有较为明显的差异，可能是由于乐亭县的滨海气候类型有关；由于大气降水的大陆效应，从海岸到内陆，δ2H和δ18O值逐渐下降[25]，因此这可能是导致乐亭县桃的2H和18O同位素较为富集的原因，进一步的研究需要对水源样品进行采集分析，以明确果实中H、O同位素的地域分布原因和各种水源对果实氢氧同位素组成的贡献率。H、O同位素分布与农作物生长季节有关，因此样本成熟季节的差异可能会影响产地区分效果，本研究采集的样品涉及久保、绿化九等7～8月份不同成熟期的样品，由于成熟时间不同而存在气候差异，可能会导致同一产地样本的同位素分馏差异，进而影响了判别的准确性。

作物中的稀土元素主要吸收于种植地的土壤，而土壤中稀土元素的种类和丰度具有地质特异性，因此理论上特定产地的农产品及制品中矿质元素具有指纹特性，国内外学者利用稀土元素对南瓜籽油[26]、茶叶[27-28]、 紫菜[29]、大米[30]进行了大空间尺度的产地溯源应用，并取得了较为理想的判别效果。而本研究所涉及产地的空间差异相对较小，4 个产地均为华北地区较典型的棕壤土或褐土，且均没有稀土矿或毗邻稀土矿区，因此4 个产地的16 种稀土元素含量未出现数量级的差异，但是同一个产地的大桃样品稀土元素含量分布区间较宽，本研究测定稀土元素时所分析的样品为水果匀浆样，由于稀土金属通常以离子形式存在而在果汁和固形物中均有分布，因此水果匀浆样在称取时的精密度要低于冻干的固体粉末样品，这可能是导致同一产地的稀土元素含量变化较大的原因，进一步的研究需深入探讨分析样品部位对溯源指标值的影响。本研究将不同产地之间具有显著差异特征的稀土元素结合稳定同位素指纹特征进行多元素多指标的统计建模，实现了小空间尺度下大桃产地的有效判别。本研究建立的判别模型在进行留一交叉检验发现，永清桃的误判率相对较高（达23.1%），其中7.7%被误判为乐亭桃，15.4%被误判为平谷桃，地域相近因素可能是永清桃误判率相对较高的原因。而平谷大桃也有2.3%样本被误判为乐亭桃，被误判样本来自平谷区的低海拔区域。样本数量是影响判别模型准确率的因素之一，本实验的判别模型包含12 个变量，尽管样本总量达到变量个数5 倍以上，但不同分类之间的样本数量不均一（仅1 个产区的样本量超过30 个），降低了模型的稳健性。基于稳定同位素和稀土元素指纹特征，对北京和河北地区大桃产地判别的准确率可达95.7%，因此本研究为小空间尺度的果品产地溯源提供了参考。为了实现对小空间尺度的桃产地进行100%的准确区分，建议应综合考虑品种、季节、种植等因素进行多层次分析，且应结合更多的溯源指标（如其他矿物元素、有机成分、光谱特征等）进行统计建模，此外还需获取足够的有统计意义和代表性的样本量，才能构建出稳健、有效的产地判别模型。