抑制OCT4-pg5与OCT4B表达对膀胱癌顺铂敏感性的影响

周五二，杨成林，王尉，聂海波，张小明，肖远松，王葵，曹智

南部战区总医院泌尿外科，广州 510010

复发、耐药是膀胱癌治疗所面临的重要难题。以铂类为基础的联合化疗方案吉西他滨+顺铂(gemcitabine+cisplatin，GC)和氨甲蝶呤+阿霉素+长春新碱+顺铂(methotrexate+adriamycin+vincristine+cisplatin，MAVC)为膀胱癌化疗的一线方案，虽然在一定程度上延长了患者的生存期，但由于膀胱癌细胞对化疗药物的耐药性，患者总体预后仍较差，其有效率仅为35%～60%[1]。八聚体结合转录因子4假基因5(octamer-binding transcription factor 4 pseudogene 5，OCT4-pg5)是八聚体结合转录因子4(octamer-binding transcription factor 4，OCT4)的假基因之一；OCT4B是OCT4基因家族的一种基因亚型。研究表明，OCT4-pg5与OCT4B在膀胱癌细胞及组织中高表达[2-3]。本研究主要探讨OCT4-pg5与OCT4B的表达对膀胱癌细胞顺铂敏感性的影响，为膀胱癌的治疗提供一种新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂及仪器 人膀胱癌细胞株5637、T24和膀胱上皮永生化细胞SV-HUC-1购自美国ATCC细胞库，保存于南部战区总医院实验科细胞库。23例膀胱癌及癌旁组织系2013年12月－2015年6月南部战区总医院泌尿外科留存的膀胱癌组织，于-80 ℃保存。si-OCT4-pg5、si-OCT4B及对照用空质粒均由广州维伯鑫生物科技有限公司构建。顺铂(美国Sigma公司)，脂质体2000(Lipofectamine 2000，美国Invitrogen公司)，细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8，日本Dojindo公司)，细胞凋亡检测试剂盒(Annexin V/PI apoptosis kit)、细胞周期染色试剂盒(中国联科生物技术股份有限公司)。流式细胞仪(FACS Calibur，美国BD公司)；荧光定量PCR仪(Mx3000P，美国Agilent Stratagene公司)。

1.2 细胞培养 人膀胱癌细胞5637、T24和上皮细胞SV-HUC-1采用RPMI 1640完全培养液(含10%FBS)于25 cm2细胞培养瓶中常规培养，当细胞生长至80%融合时用于实验。

1.3 反转录实时定量PCR(reverse transcription qPCR，RT-qPCR)检测OCT4-pg5、OCT4B mRNA表达水平 提取细胞及组织总RNA，以β-actin为内参进行RT-qPCR检测。引物序列：OCT4-pg5-F，TTGCTGCAGAAGTGGGTGGAGGAAG；OCT4-pg5-R，GTACCAAAATGGGAGCCTGGGGC；OCT4B-F，TATTCAGCCAAACGACCATC；OCT4B-R，GCTTCCTCCACCCACTTCT；β-actin-F，ATCGTGCGTGACATTAAGGAGAAG；β-actin-R，AGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG。PCR反应条件：95 ℃预变性2 min；94 ℃ 20 s，58 ℃20 s，共40个循环。熔解曲线分析：65～95 ℃。每个样品重复3次，采用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。选择OCT4-pg5、OCT4B高表达的细胞株进行后续实验。

1.4 CCK-8检测细胞增殖 选取对数生长期的OCT4-pg5、OCT4B高表达细胞株，以5000个/孔接种于96孔板中，待融合度达80%后，按照说明书用Lipofectamine 2000进行si-OCT4-pg5质粒或si-OCT4B质粒瞬时转染；细胞借此分为si-OCT4-pg5组、si-OCT4B组、si-OCT4-pg5/si-OCT4B组，并设转染空质粒的对照组；转染后细胞于孵箱内培养6 h，更换培养基，各组按梯度浓度加入顺铂，使其终浓度为0、10、20、90 μmol/L，每个浓度设置6个复孔；继续培养48 h，弃旧培养基，加入含10% CCK-8试剂的RPMI 1640培养基，37 ℃孵育4 h后，检测450 nm处的OD值，计算各组顺铂的半数抑制浓度(IC50)。

1.5 Western blotting检测OCT4B蛋白表达水平对数生长期的OCT4-pg5、OCT4B高表达细胞株以1×105个/孔的密度接种至6孔板培养，经质粒转染及顺铂(浓度采用对照组IC50)处理，继续培养48 h，收集各组细胞，提取蛋白质；采用Western blotting法检测OCT4B蛋白表达水平，鼠抗人OCT4B单克隆抗体按1:1000稀释；用Image-Pro Plus 6.0进行条带灰度值分析。以GAPDH为内参蛋白，相应蛋白的表达量=待测蛋白灰度值/内参蛋白灰度值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期分布细胞凋亡检测：将处理后的各组细胞用0.25%胰酶消化并制成单细胞悬液，移至流式管，1000 r/min离心5 min，弃上清，加入200 μl Annexin V/PI染色工作液重悬细胞，避光孵育15 mim，上机检测。细胞周期检测：将处理后的各组细胞制成单细胞悬液，移至流式管，PBS洗涤后去除上清，一边震荡一边加入-20 ℃预冷的70%乙醇1 ml重悬固定；样品于-20 ℃保存；染色当天取出样品，1000 r/min离心5 min，PBS洗涤2次，加入300 μl PI染色液，避光染色15 min，上机检测。

1.7 统计学处理 采用SPSS 22.0软件进行统计分析。实验数据均以表示，采用Graphpad Prism 5.0软件作图。所有实验均重复3次，两组数据之间差异比较均采用t检验，相关性分析采取Pearson相关法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 膀胱癌细胞及组织中OCT4-pg5、OCT4B mRNA的表达水平分析 RT-qPCR检测结果显示，OCT4-pg5与OCT4B在膀胱癌细胞5637及T24中均呈高表达，其中T24细胞表达水平最高，与正常尿路上皮细胞SV-HUC-1相比，差异均有统计学意义(P＜0.01，图1A)。OCT4-pg5、OCT4B mRNA在膀胱癌组织中的表达量分别为576.59±352.40、763.00±460.63，较癌旁组织(221.89±121.04，269.07±161.68)均明显增高(P＜0.01，图1B)。Pearson相关性分析发现，OCT4-pg5与OCT4B的mRNA表达在23例膀胱癌组织中呈正相关(r=0.73，P＜0.01，图1C)。

2.2 OCT4-pg5、OCT4B表达水平对T24细胞顺铂敏感性的影响 选择OCT4-pg5、OCT4B高表达的细胞株T24进行后续实验。瞬时转染si-OCT4-pg5、si-OCT4B质粒，并加入不同浓度顺铂作用48 h后，CCK-8实验结果显示，si-OCT4-pg5组、si-OCT4B组及两种干扰质粒共转染的si-OCT4-pg5/si-OCT4B组T24细胞顺铂的IC50分别为(61.52±5.09) μmol/L、(50.84±4.68) μmol/L、(29.41±3.84) μmol/L，与对照组[(85.00±7.63) μmol/L]相比均降低，差异有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01，图2)，其中si-OCT4-pg5/si-OCT4B组的IC50降低最为明显。

图1 OCT4-pg5、OCT4B mRNA在膀胱癌细胞及组织中的表达Fig.1 Expression of OCT4-pg5 and OCT4B in bladder cancer cells and tissues

图2 OCT4-pg5、OCT4B表达水平对T24细胞顺铂敏感性的影响Fig.2 Effects of Oct4-pg5 and OCT4B expression on cisplatin sensitivity of T24 cells

2.3 顺铂作用下T24细胞OCT4-pg5、OCT4B表达水平的调控

2.3.1 si-OCT4-pg5、si-OCT4B质粒转染降低OCT4-pg5、OCT4B的表达 瞬时转染si-OCT4-pg5、si-OCT4B质粒至T24细胞，并以85 μmol/L顺铂作用48 h后，RT-qPCR结果显示，si-OCT4-pg5和si-OCT4B质粒转染组的OCT4-pg5、OCT4B mRNA表达水平分别为0.49±0.04、0.40±0.03，与各自的对照组(1.00±0.10，1.00±0.04)相比均明显降低，差异有统计学意义(P＜0.01，图3A、B)。

2.3.2 干扰OCT4-pg5表达下调T24细胞OCT4B mRNA、蛋白表达水平 RT-qPCR及Western blotting检测结果显示，与对照组相比，si-OCT4-pg5组细胞OCT4B的mRNA(0.64±0.08vs.1.00±0.04)及蛋白(0.34±0.05vs.0.63±0.06)表达均显著降低(P＜0.05，P＜0.01，图3B、3C)；si-OCT4-pg5、siOCT4B共转染组细胞OCT4B的mRNA(0.18±0.04vs.1.00±0.04)及蛋白(0.01±0.00vs.0.63±0.06)表达下降最为明显(P＜0.01，图3B、C)。

2.4 干扰OCT4-pg5、OCT4B表达协同促进顺铂诱导T24细胞凋亡 流式细胞术结果显示，在顺铂作用下，si-OCT4-pg5组、si-OCT4B组T24细胞凋亡率分别为(26.37±3.74)%、(32.73±3.84)%，较对照组[(8.77±1.78)%]明显增高(P＜0.01，图4)；si-OCT4-pg5、si-OCT4B共转染的T24细胞凋亡率(44.60%±2.71%)增加则更为明显(P＜0.01，图4)。

图3 顺铂对T24细胞OCT4-pg5、OCT4B表达水平的调控Fig.3 Regulation of OCT4-pg5 and OCT4B expression levels in T24 cells after cisplatin treatment

2.5 干扰OCT4-pg5、OCT4B表达增强T24细胞G0/G1期阻滞 流式细胞术结果显示，分别下调OCT4-pg5、OCT4B的表达或共同下调两者表达水平后，细胞G0/G1期占比分别为64.75%±4.17%、69.46%±2.91%、75.92%±2.09%，S期细胞比例分别为24.08%±1.22%、15.69%±3.01%、8.62%±2.62%，相较对照组(G0/G1期：54.86%±3.45%，S期：32.45%±1.92%)，G0/G1期细胞占比均增加，S期细胞占比均减少(图5)。

图4 流式细胞术分析干扰OCT4-pg5、OCT4B表达对顺铂诱导T24细胞凋亡的影响Fig.4 Effect of suppression of OCT4-pg5 and OCT4B on cisplatin-induced T24 apoptosis by flow cytometry

3 讨 论

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。顺铂作为膀胱癌一线化疗药物，其抗癌的主要机制涉及DNA损伤及诱导线粒体凋亡[4]，但化疗耐受的发生常导致治疗失败[5]。因此，阐明肿瘤细胞顺铂耐药的机制具有重要意义。

OCT4通过拼接可产生三种亚体，分别是OCT4A、OCT4B、OCT4B1，主要功能是维持胚胎干细胞的多能性和自我更新[6]。目前研究最多的是OCT4A亚型，其在多种实体瘤，如胃癌、前列腺癌、肺癌等的发生过程中起着关键作用[7-8]。相关免疫组化研究表明，在膀胱癌组织中检测到的OCT4基因主要是细胞质表达的OCT4B亚型[9]；Wezel等[3]在人正常尿道上皮及尿路上皮癌中检测到OCT4B或其他假基因在细胞质的表达。近年来，关于OCT4B在肿瘤中的作用研究逐渐增多，例如在肺腺癌中抑制OCT4B的表达可以促进顺铂诱导的细胞凋亡，进而增强肿瘤细胞对顺铂的药物敏感性[10]，提示OCT4B可能在膀胱癌的进展中也发挥作用。

图5 干扰OCT4-pg5、OCT4B表达对顺铂作用下T24细胞周期分布的影响Fig.5 Cell cycle analyses of T24 treated with cisplatin after si-OCT4-pg5 and si-OCT4B transfection

OCT4-pg5是OCT4的假基因之一，不编码功能蛋白，早期研究发现OCT4-pg5在膀胱癌细胞及组织中呈差异表达，表明其可能与肿瘤的发生相关[2,11]。本研究RT-qPCR实验结果表明，OCT4-pg5与OCT4B mRNA在膀胱癌细胞5637、T24及膀胱癌组织中均高表达，且两者在膀胱癌组织中的表达呈正相关关系。通过基因干扰技术下调OCT4-pg5或OCT4B的表达后，构建了OCT4-pg5与OCT4B低表达细胞模型，RT-qPCR及Western blotting检测结果显示，干扰OCT4-pg5表达可下调T24细胞OCT4B mRNA、蛋白的表达水平。流式细胞术实验进一步表明，干扰OCT4-pg5、OCT4B的表达可促进顺铂诱导的T24细胞凋亡，增加G0/G1期细胞占比，减少S期细胞占比，且两者共同下调对增加T24细胞的顺铂敏感性存在协同作用，表明OCT4-pg5或OCT4B的表达增加可以增强T24细胞对顺铂的抵制作用。

假基因由蛋白质编码基因发展而来，但已经失去了编码蛋白质的能力，其作用可能是通过提高其同源蛋白质编码基因的表达而参与肿瘤发生、发展进程[12]。相关研究预测，OCT4-pg5可能通过靶向miR-145-5p上调OCT4相关基因而参与肿瘤进程[13]。也有研究表明OCT4假基因与OCT4亚型基因之间存在共同的miR-145-5p靶向结合区域[11]。本研究发现，干扰OCT4-pg5表达后，T24细胞OCT4B mRNA及蛋白的表达降低，提示膀胱癌中OCT4-pg5可以调控OCT4B的表达，其也可能是通过靶向miR-145-5p上调OCT4B的表达，进而参与顺铂耐药的发生。

综上所述，干扰OCT4-pg5或OCT4B的表达均可增强膀胱癌T24细胞对顺铂的药物敏感性，表现为促进细胞凋亡、增加细胞G0/G1期阻滞率。后续研究将进一步探讨OCT4-pg5是否可作为竞争性内源性RNA(competitive endogenous RNAs，ceRNA)上调OCT4B的表达，参与膀胱肿瘤细胞顺铂耐药的发生过程。