妊娠合并宫颈癌中唾液内源性磷酸化肽段的诊断价值

江絮萍，李杰萍，何拉曼，黄海燕

0 引 言

宫颈癌是女性发生频率很高的恶性肿瘤，仅次于乳腺癌[1-3]。国际上通常把妊娠期、产褥期和产后6个月内发生的宫颈癌称为妊娠合并宫颈癌，也称妊娠相关性宫颈癌[4]。目前，宫颈癌筛查和诊断的方法主要分为三步：首先是初筛，即进行阴道分泌物或脱落细胞涂片；初筛阳性患者再进行阴道镜检；镜检结果怀疑癌变患者则最后通过镜下取活组织做病理切片确诊[5-6]。对于妊娠期妇女而言，由于担心宫颈检查或取活组织产生的创伤引起流产，部分患者在产前检查时不检查宫颈或不进行宫颈细胞学检查，从而导致漏诊和误诊。此外，阴道流血容易被误认为与妊娠有关，从而忽略上述检查[7]。因此，寻找一种新的既无创简便，同时又准确高效的妊娠合并宫颈癌诊断方法是十分有意义的。

唾液作为一种极易取得，且成分同身体健康状况高度相关的体液，在近10余年中已经成为很多肿瘤诊断技术研究中的诊断液[8-9]。唾液的成分复杂[10]，蛋白/肽段种类极其丰富[11]。肿瘤的发生、发展和转移同异常的蛋白/肽段的磷酸化水平通常有很强的关联性，而体内蛋白/肽段的磷酸化水平变化会直接在唾液中表现出来[12-14]。因此，可以通过直接分析唾液中内源性磷酸化肽段(不用酶解而直接存在的磷酸化肽段)来进行疾病的早期诊断。目前，唾液中内源性磷酸化肽段的表达种类与表达量用于妊娠合并宫颈癌诊断的相关研究还不完善。为此，本研究采集Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者和健康孕妇的唾液，对其中的内源性磷酸化肽段进行富集后，再利用基质辅助激光解析(Matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI)质谱进行定性定量检测。根据质谱数据分析其中的差异，初步探究唾液内源性磷酸化肽段在妊娠合并宫颈癌中的诊断价值。

1 资料与方法

1.1 研究对象选择2016年至2018年期间在武警福建省总队医院妇产科生产的健康孕妇(38例)，以及同期在武警福建省总队医院(10例)、上海第一妇婴(18例)和福建省人民医院(8例)接受妊娠合并宫颈癌检查的患者。妊娠合并宫颈癌患者的纳入标准：①按照2009年FIGO临床分期标准划分，经病理检查证实为Ⅰ～Ⅲ期宫颈癌；②具有完整的诊疗记录；③采样前未接受肿瘤切除手术；④采样前未接受放疗或化疗。排除标准：除宫颈癌外，还患有其他重大疾病的患者。健康孕妇的纳入标准为未诊断出患有重大疾病。共有74例受试者纳入本研究，年龄(33.9±14.3)岁。其中，健康孕妇38例(健康孕妇组)，年龄(33.1±13.5)岁。妊娠合并宫颈癌患者36例，年龄(36.1±12.1)岁，按临床分期分为：Ⅰ期组12例，年龄(32.4±8.4)岁；Ⅱ期组13例，年龄(34.1±14.1)岁；Ⅲ期组11例，年龄(35.2±10.7)岁。本研究经医院伦理委员会批准(批准号：第12号)，所有受试者均签署知情同意书。

1.2唾液采集方法每位健康孕妇在妊娠中期(20～28周)内采集唾液样品2份，每位患者在确诊为妊娠合并宫颈癌后3 d内采集唾液样品2份。所有受试者均在上午10-11点之间采集唾液。采集前2 h内禁止饮食，采集前10 min清洗口腔。使用德国萨斯特公司(Sarstedt)的唾液采集管，并按照其推荐步骤采集唾液。每份获得的唾液样品各取200 μL置于离心管中，冷冻离心干燥后存于-80 ℃冰箱待用。

1.3唾液内源性磷酸化肽段富集方法使用美国赛默飞世尔公司(ThermoFisher)的磷酸化肽段富集试剂盒(High-Select TiO2Phosphopeptide Enrichment Kit)，并按照试剂盒的推荐步骤依次操作，完成对上述干燥后的唾液样品的富集。最终得到的含磷酸化肽段的洗脱液为质谱测试样品。

1.4质谱测试方法使用美国爱博才思公司(AB SCIEX)的5800 MALDI-TOF/TOF质谱分析样品。具体步骤为取1 μL洗脱液点在MALDI靶板上，干燥后再点上0.7 μL DHB(25 mg/mL)基质，再次干燥后进行质谱分析。质谱检测质荷比(m/z)范围1000～3000。每份洗脱液均按上述方法在靶板上点2个样品点，每个点进行2次质谱分析。除正常的质谱测试外，在健康孕妇及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者的洗脱液样品中各随机选取一份，分别进行7次重复性实验(内源性磷酸化肽段+质谱分析)。

1.5质谱数据分析定性分析方法：首先选出一张谱图中所有信噪比(S/N)≥10的一级质谱峰，依次进行串级质谱分析；如主要碎片离子同母离子相差98 Da(丢失H3PO4)，则证明母离子中含有磷酸根，母离子对应肽段为磷酸化肽段；后续的谱图中，如发现同之前鉴定到的磷酸化肽段质荷比数相差±0.1 Da以内的一级质谱峰，即认为是同一磷酸化肽段，不用再次进行串级质谱分析。

定量分析方法：直接使用质谱信号强度代表谱图中的磷酸化肽段丰度；未鉴定到的磷酸化肽段丰度记为0；每例受试者的唾液磷酸化肽段丰度使用全部8张谱图(2份唾液样品×每份样品2个样品点×每个样品点质谱分析2次)的平均值。

各组受试者中各条唾液内源性磷酸化肽段的相对丰度的计算方法为：首先计算各条磷酸化肽段在各组受试者唾液样品中的平均丰度；然后将所有磷酸化肽段在各组中的平均丰度分别在各组之间进行归一化(令最大值为100)，得到最终表内数据。相对丰度为0即为在该组中未鉴定到该条肽段。

健康-妊娠合并宫颈癌P值的计算方法为：对于任意一条唾液磷酸化肽段，将38例健康孕妇组中每例受试者的对应唾液磷酸化肽段丰度数据，同36例Ⅰ～Ⅲ期宫颈癌患者组中每例受试者的对应唾液磷酸化肽段丰度数据相比较，使用t检验的方法计算P值。

按照每条磷酸化肽段的相对丰度同该条磷酸化肽段在各组受试者唾液样品中的平均丰度的哪个值最接近就判断为对应的疾病状态，再同实际临床诊断结果相比对，统计得到各条磷酸化肽段在不同组癌症患者中的诊断准确率。

1.6统计学分析使用SPSS 22.0软件进行统计学处理。计量资料采用平均数表示，组间比较采用t检验。计数资料以例数(百分率)表示，采用卡方检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 唾液内源性磷酸化肽段检测方法的验证不经过富集，直接进行MALDI质谱分析的唾液样品的质谱谱图中无磷酸化肽段质谱信号峰。经过富集后，再进行MALDI质谱分析的唾液样品的质谱谱图中磷酸化肽段质谱峰清晰可见。典型的受试者的唾液样品在进行磷酸化肽段富集前后的MALDI质谱图见图1。在所有24条信噪比大于10的质谱峰中有16条磷酸化肽段，比例高达67%(16/24)。重复性实验结果发现，4组唾液样品在7次重复性实验中鉴定磷酸化肽段种类的重合度均大于90%，相同质谱峰的信号强度的相对标准偏差(RSD)均小于10%。

a：富集前(无磷酸化肽段信号)；b：富集后(磷酸化肽段，使用星号标记)

图1 一位受试者的唾液样品在进行磷酸化肽段富集前后的质谱图

2.2唾液内源性磷酸化肽段的检测结果在全部74例受试者的唾液样品中，共鉴定到25条内源性磷酸化肽段。其中，健康孕妇22条(88%，22/25)，Ⅰ期妊娠合并宫颈癌患者20条(80%，20/25)，Ⅱ期患者21条(84%，21/25)，Ⅲ期患者19条(76%，19/25)。4组受试者的唾液样品中鉴定到的内源性磷酸化肽段及其相对丰度见表1。15条(60%，15/25)唾液磷酸化肽段的丰度在健康孕妇和妊娠合并宫颈癌患者之间差异有统计学意义(P<0.05)。健康孕妇及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者之间共同存在的内源性磷酸化肽段有13条，占总共鉴定到的52%(13/25)。仅存在于健康孕妇唾液中有3条肽段(12%，3/25)，质荷比为1270.3、1589.4和2004.7。仅存在于妊娠合并宫颈癌患者唾液中有3条肽段(12%，3/25)，质荷比为1076.4、2119.7和2722.8。从健康孕妇唾液同妊娠合并宫颈癌患唾液中肽段含量的差异来看，健康孕妇唾液同Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者唾液最高的质谱信号强度之比大于2的磷酸化肽段有3条(12%，3/25)，质荷比为1270.3、1589.4、2004.7。健康孕妇唾液同Ⅰ～Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者唾液最低的质谱信号强度(不含0)之比小于0.5的有7条(28%，7/25)，质荷比为1076.4、1230.3、1461.4、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。从肽段含量的变化趋势来看，从健康孕妇到Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者唾液中含量依次增加的磷酸化肽段有2条(8%，2/25)，质荷比为1461.4和2722.8；依次下降的磷酸化肽段有1条(4%，1/25)，质荷比为1784.6。综上，共有11条唾液内源性磷酸肽段(44%，11/25)是潜在的妊娠合并宫颈癌诊断标志物。它们的质荷比分别为1076.4、1230.3、1270.3、1461.4、1589.4、1784.6、2004.7、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。仅存在于癌中的3条磷酸化肽段(质荷比为1076.4、2119.7和2722.8)能够最方便的区分出健康孕妇与妊娠合并宫颈癌患者。统计这3条磷酸化肽段在不同组癌症患者中的诊断准确率。结果为质荷比为1076.4的诊断准确率分别为Ⅰ期45%、Ⅱ期43%、Ⅲ期52%；质荷比为2119.7的诊断准确率分别为Ⅰ期66%、Ⅱ期56%、Ⅲ期51%；质荷比为2722.8的诊断准确率分别为Ⅰ期44%、Ⅱ期40%、Ⅲ期48%。

表1 各组受试者中各条唾液内源性磷酸化肽段(使用质荷比表示)的相对丰度

质荷比(m/z)健康孕妇组(n=38)Ⅰ期组(n=12)Ⅱ期组(n=13)Ⅲ期组(n=11)P值1000.247100073<0.011076.407633100<0.011114.33777100590.0421155.31004870340.0911230.319491000<0.011270.3100000<0.011311.49810083810.251386.45293100430.191426.49437901000.0921461.41969791000.0471481.599010067<0.011538.53110039890.0741589.4100000<0.011596.58313971000.0811637.64567100130.0611704.498851000<0.011752.67623100650.0871784.61009873200.0541899.637100260<0.012004.7100000<0.012119.703010072<0.012323.72310067720.0322541.815010069<0.012722.807981100<0.012837.88277151000.053

3 讨 论

3.1 唾液内源性磷酸化肽段检测方法的合理性唾液成分复杂，且内源性磷酸化肽段丰度极低[15]。直接用MALDI质谱进行分析所得到的谱图杂乱，高丰度成分将磷酸化肽段信号完全抑制，导致无磷酸化肽段信号。因此，需要先使用富集材料(如TiO2)抓取唾液中的内源性磷酸化肽段，然后通过洗涤富集材料将绝大部分非目标物质去除，最终得到杂质较少、浓度较高的磷酸化肽段洗脱液后再进行MALDI质谱分析。本研究中使用的磷酸化肽段富集试剂盒可以保证富集方法的有效性。实验结果显示在富集后的唾液MALDI质谱图中，大部分信噪比大于10的质谱峰为磷酸化肽段。与相关富集分析唾液中内源性磷酸化肽段文献相对比，本文中的富集效果(67%)同国内外的研究水平相近[16-17]。使用商用唾液采集管和磷酸化肽段富集试剂盒还可以保证整个方法的重复性。重复性实验结果显示，在各组受试者的唾液样品中，本研究采用的方法在定性和定量方面均具有较好的重复性和稳定性。这为使用唾液内源性磷酸化肽段作为指标对妊娠合并宫颈癌患者进行诊断打下了基础。

3.2唾液内源性磷酸化肽段的诊断价值唾液内源性磷酸肽段在健康孕妇及Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者之间差异有统计学意义(P<0.05)。通过这些差异，在本研究的结果部分共分析总结出11条可能成为妊娠合并宫颈癌诊断标志物的唾液内源性磷酸肽段，表明唾液内源性磷酸化肽段对妊娠合并宫颈癌具有一定的诊断价值。对于诊断指标而言，首要目的是区分健康与疾病状态。在上述11条肽段中，3条仅存在于健康孕妇唾液中(m/z：1270.3、1589.4和2004.7)和3条仅存在于妊娠合并宫颈癌患者唾液中(m/z：1076.4、2119.7和2722.8)的内源性磷酸化肽段能最清楚的区分健康孕妇和Ⅰ期妊娠合并宫颈癌患者。同时，根据仅存在于癌中的3条肽段的量的差异，还可以进一步区分具体的Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期。对于癌症而言，早期癌症患者有更高的几率可以治愈，而晚期的癌症患者则通常难以治愈[18]。因此癌症的早期诊断具有更重要意义。值得注意的是，质荷比为2119.7的唾液内源性磷酸化肽段诊断Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者的准确率均超过了50%，且诊断Ⅰ期妊娠合并宫颈癌患者的准确率达到了66%。说明该唾液内源性磷酸化肽段可以较准确的区分出Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ期(特别是Ⅰ期)妊娠合并宫颈癌患者，具有诊断早期妊娠合并宫颈癌的能力。这一准确率水平同现有文献中报道的通过检测血清miRNA[19-22]，或者联合检测组织中蛋白标志物[23]，从而进行宫颈癌早期诊断的方法相近。当然，由于使用的样品为唾液，因此本文的方法更加简便，对患者无伤害。

综上所述，唾液内源性磷酸化肽段在妊娠合并宫颈癌中有很高的诊断价值。本研究共发现11条唾液内源性磷酸肽段是潜在的妊娠合并宫颈癌诊断标志物。其中，质荷比为2119.7的磷酸化肽段还可以较准确的区分具体的癌症临床阶段。特别是利用该磷酸化肽段区分Ⅰ期妊娠合并宫颈癌的准确率达到了66%，具有重要的研究意义和早期诊断价值。当然，这些唾液内源性磷酸化肽段诊断妊娠合并宫颈癌的可靠性还有待未来更多的临床样本进行验证。