一株磷酸盐还原菌除磷的特性研究

谭舒波，徐丽，刘潇锋

一株磷酸盐还原菌除磷的特性研究

谭舒波，徐丽，刘潇锋

（沈阳建筑大学 环境工程系，辽宁 沈阳 110168）

在厌氧-缺氧环境下，从污水处理厂的厌氧池中筛选出一株高效的磷酸盐还原菌，命名为 YING18。对该菌株进行了生理生化研究及 16SrDNA 序列分析，并对该菌株的除磷效率和影响除磷特性的因素进行了研究。结果显示：磷酸盐浓度可以影响微生物的磷酸盐还原能力，随着磷浓度的增高，磷酸盐还原菌的生长速率会加快，磷的去除量会增加，碳磷比为150∶1时最佳，四种微量元素的最佳配比： Mo为100 mg/L、Ni为20 mg/L、Co为100 mg/L、Fe为50 mg/L，发现 Mo 元素对磷酸盐还原菌的影响效果最大，其次是 Ni、Co 和 Fe。

磷酸盐还原菌；磷浓度；微量元素

磷酸盐可以在一定条件下被还原成磷化氢气体，这为除磷工艺提供便捷，但是很少报道磷酸盐还原菌的生长和除磷特性。为了让人们了解磷酸盐还原菌的除磷能力和生长特性，本实验根据厌氧反应为理论基础，在厌氧环境下，选取有磷酸盐还原菌的污泥作为种泥，通过驯化和富集，分离出功能细菌，并对分离出的磷酸盐还原菌进行除磷能力和生长特性的研究，愿为除磷工艺提供新思路。

1 实验部分

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种

接种污泥取自污水处理厂中厌氧池，含水率约为 98%，pH 为 7.4，MLSS 质量浓度为 4.53 g/L，MLVSS 质量浓度为2.36 g/L。

1.1.2 培养基

基础培养基成分：葡萄糖作为碳源，氯化铵作为氮源，磷酸氢二钠作为磷源，其他参见具体方案。

富磷发酵培养基：C6H12O60.9 g，Na2PO4·12H2O 0.46 g，NH4Cl 0.76 g，微量元素共0.3 mL ，配比见表 1。

表1 微量元素质量浓度

1.2 实验方案

1.2.1 污泥驯化

污泥取自抚顺三宝屯污水处理厂的厌氧池内，进行污泥浓度调整，大约3 750 mg/L ，进行观察，每两天测定PO43--P去除率、COD以及磷化氢的产量[1]-[4]，据此判断污泥的驯化程度。

1.2.2 菌株的分离提纯及筛选

待装置中运行状态稳定后，取含驯化富集的磷酸盐还原菌活性污泥，进行菌种分离的方法为涂布接种法。在30 ℃的温度下培养 3～5 d ，看到分散菌落，在10-5、10-6浓度的培养皿内菌落密度较为适宜。重复划线 4～5 次，结合对菌落的观察和革兰氏染色的结果，选出菌株，在三角烧瓶中装入配置好的液体培养基，吹入氮气排除空气，121 ℃灭菌 20 min，冷却放置。在30 ℃的恒温培养箱中培养纯化后的细菌24 h，进行富集培养[5]-[7]。

菌株初筛后将得到的细菌分别接种于含磷发酵培养基的厌氧管中（PO43--P 为 10 mg/L）记录细菌的颜色、边缘、透明度等形态，包括革兰氏染色后的形态，培养 3 d 后，挑选出6 株去除率超出 20%的细菌进行磷化氢产气的实验，再将具有除磷能力良好的细菌接种于磷化氢检测装置中进行复筛[8，9]。

1.2.3 菌株的鉴定

（1）凝胶成像：实验中采用TaKaRa 试剂盒，将基因组 DNA 纯化取出备用，方法可见试剂盒说明书。将 4 μL的 PCR 扩增后的 DNA 液与分于硫酸纸上的N 滴 6×loading buffer 混合均匀。并用移液枪将混合后的液体打入凝胶槽点样孔中。注意注入5 μL marker-dl2000于第一个和最后一个槽孔中，在电泳仪上运行，并在凝胶成像仪的载物台中央区域放置凝胶，运行并拍照保存。

（2）PCR测序：使用 TaKaRa 试剂盒，将基因组 DNA 纯化后提取出来备用[10]。16SrDNA 扩增的引物分别为:CHPN856-01 正向引物；CHPN856- 02 反向引物；94 ℃中持续3 min；之后在94 ℃、55 ℃、72 ℃中各停留30 s， 共 30 个循环；之后在72 ℃中停留5 min；4 ℃终止保存。PCＲ 产物外送进行测序。

1.3 磷酸盐还原菌特性实验研究

1.3.1 磷浓度对细菌的生长和除磷性能的影响

细菌接入磷源浓度分别为10、20、30 mg/L的基础培养基，然后在30 ℃恒温震荡培养箱中以120 r/min培养，每隔6 h取样测定菌液浓度和菌液中总磷的浓度。

1.3.2 碳磷比对细菌的生长和除磷性能的影响

细菌接入碳磷比调整为50∶1、80∶1、100∶1、120∶1、150∶1的基础培养基中，其中磷酸盐浓度为10 mg/L，并置于30 ℃,120 r/min的恒温震荡培养箱中培养，每6 h取样测定菌液中总磷的浓度和菌液浓度。

1.3.3 微量元素及配比对细菌的除磷性能和生长的影响

富磷发酵培养基：C6H12O60.9 g，Na2PO4·12H2O 0.46 g，NH4Cl 0.76 g，微量元素共0.3 mL。本实验选取Mo、Ni、Co、Fe 4种元素，通用正交法分析实验，采取Mo、Ni、Co、Fe四因素，20、50、100 μg/L三水平，具体如表2。

表2 微量元素浓度

按照正交实验的实验表的方法，实验安排如表3所示。

表3 实验编号

细菌浓度测定：吸取反应完成后水样，使用分光光度计测定菌液的吸光度值波长为600 nm，以空白样为空白培养基，此时菌液的吸光度值表示混合液中细菌的浓度。其他检测方法见表4。

表4 检测方法

2 结果与讨论

2.1 污泥训化及菌株的分离纯化筛选

通过调节反应器 pH、营养比例及温度，得到较为理想的水平的污泥。分离纯化是通过涂布接种法，最终有22株菌株，以上述方法在富磷培养基和预培养基中培养，并测定除磷率，发现 YING18 菌株除磷率较高，进行下一步研究。

2.2 菌株的鉴定

2.2.1 凝胶成像电泳结果

图1 扩增产物琼脂糖凝胶电泳成像图

对 YING18 菌DNA提纯并进行PCR扩增，得到 DNA 片段，图 1为对 PCR扩增产物的电泳图片。将 marker-dl2000 标准条带与结果比对，发现条带清晰明亮，无杂质。

2.2.2 PCR测序结果

经过 Blast 对比，得出菌株 YING18与在NCBI 上登录号为 Enterobacter sp.KC736654.1相似度为 99%，是最高的，是肠杆菌属。

2.3 磷酸盐还原菌特性实验

2.3.1 磷浓度对细菌的生长和除磷性能的影响

荣宏伟等人发现磷浓度会影响微生物的群落结构[11]。由此探究磷浓度与YING18菌生长之间的作用，设置实验浓度为10、20、30 mg/L三个浓度梯度，将磷酸盐分别接种于6个厌氧管中，调整pH为8，温度为30 ℃。如图2所示为不同磷酸盐浓度下，磷酸盐还原菌的生长曲线。

图2 磷浓度对磷酸盐还原菌生长的影响

如图2所示，在三种初始磷浓度为10、20、30 mg/L的磷源培养基中，细菌的数量在40 h以后达到最大值，说明细菌生长引起了培养基吸光度的变化。不同培养基中，判定对细菌生长有利到不利三种初始磷浓度的依据为细菌达到稳定期的先后顺序，结果为：30 mg/L>20 mg/L>10 mg/L。

由上可知，磷源对菌株的生长速度有影响，而磷浓度是否促进磷酸盐还原的效率还有待研究。因此，为加强对不同磷酸盐浓度与磷酸盐还原菌除磷效果关系的了解，本实验磷源选择磷酸氢二钠10、20、30 mg/L，在6个厌氧管中分别接种三个浓度梯度的磷酸盐，pH调整为8，温度调整至30 ℃。连续培养48 h，测定TP的含量，注意用0.22 μm的微孔滤膜过滤上清液，实验结果如表5所示。

表5 磷浓度对磷酸盐还原菌除磷的影响

由表5可知，培养基内升高磷浓度，能够使磷酸盐去除率减低，因为培养基中磷的逐渐增加，已超出微生物所需的磷，而微生物的除磷能力是有限的，碳源虽已远超上限，但微生物的去除率却不能上升。而在不同浓度下磷的增加，会使微生物去除磷酸盐的总量得到了提升，从浓度为10 mg/L去除了3.28 mg/L到浓度为30 mg/L去除了3.67 mg/L，虽然微生物的除磷率在下降，但是对磷酸盐的还原能力有所提升。

2.3.2 碳磷比对细菌的生长和除磷性能的影响

孙亮等人在研究磷化氢释放过程中发现，磷化氢的产气量受不同碳磷比这一条件影响[12]。本实验碳磷比设置为50∶1、80∶1、100∶1、120∶1、 150∶1，在厌氧管中接种5个碳磷比浓度梯度的磷酸盐，pH调整为8，温度调整至30 ℃。如图3所示，在不同碳磷比条件下的磷酸盐还原菌生长曲线。

图3 碳磷比对磷酸盐还原菌生长的影响

如图3所示，在30 h后培养基中的细菌浓度在陆续增加，数量最高值也因碳磷比不同而有差异。由图中生长趋势可知，5种培养基中的细菌在30 h前生长速率相差不大，但随后在培养基中的最大细菌浓度因碳磷比的增大而增加，当碳磷比为150∶1时，最大的细菌浓度为2.12；最小的细菌浓度仅为1.10，此时的碳磷比为50∶1 。

为对磷酸盐还原菌受碳磷比影响这一现象的研究，实验如下设置，碳磷比取50∶1、80∶1、 100∶1、120∶1、150∶1，将这5种碳磷比分别置于厌氧管中，温度为3 0℃，调整pH为8，进行连续培养，48 h后用0.22 μm的微孔滤膜过滤得到上清液，测定TP含量，结果如图4所示。

由图4可得到实验结果，在碳磷比不同的条件下，TP的去除率会随着碳磷比的增加而逐渐增加，去除率最高时的碳磷比为150∶1，这时TP浓度为10.21，去除率为46.62%。

2.3.3 微量元素配比对细菌的生长和除磷性能的影响

指标设为TP去除率和菌悬液的OD600，将3水平4因素数据填入表中，正交实验结果见表6。

图4 碳氮比对除磷的影响

表6 微量元素的种类及浓度对磷酸盐还原菌生长的影响

在表格中用A、B、C代表浓度水平实验结果之和，R值为某一水平的最大与最小值的差值平均值，A、B、C能够反应出水平条件对实验结果的影响程度，R值则表示在水平条件下某因素对实验的影响。如表6所示，由实验数值可以得出结论，对磷酸盐还原菌的生长及除磷效率影响由大到小的顺序依次为Mo、Ni、Co、Fe。最佳浓度配比：Mo为100 mg/L、Co为100 mg/L、Ni为20 mg/L、Fe为50 mg/L。

3 结束语

增加磷浓度能促进磷酸盐还原菌生长速率，增大除磷量，但是碳源能限制增加培养基中的总生物量。在以碳磷比为影响因素，以磷酸盐还原菌的生长及除磷能力为研究对象时，结果显示：当不限制因素磷浓度时，培养基中的生物量和TP的去除率都会随着碳浓度的提升而增加。探究四种微量元素Mo、Co、Ni、Fe的配比对磷酸盐还原菌的生长和除磷能力的影响时，结果显示 Mo 元素对磷酸盐还原菌的影响效果最大，其次是 Co、Ni 和 Fe。其中最佳微量元素浓度为Mo为100 mg/L、Co为100 mg/L、Ni为20 mg/L、Fe为50 mg/L。

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Study on Characteristics of a Phosphate Reducing Strain

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(Shenyang Jianzhu University, Liaoning Shenyang 110168, China）

In an anaerobic-anoxic environment, an efficient phosphate reducing bacteria was screened out from the anaerobic tank of sewage treatment plant and was named as YING18.Physiological and biochemical studies and DNA sequence analysis of the strain were carried out.The dephosphorization effect of the strain and the factors affecting its characteristics were studied.The results showed that, phosphate concentration could affect the phosphate reduction ability of microorganisms.The growth rate of phosphate reducers accelerated and phosphorus removal rate increased with the increase of phosphorus concentration.The best ratio of carbon to phosphorus was 150∶1.The optimum ratio of the four trace elements was as follws: Mo=100 mg/L,Ni=20 mg/L,Co=100 mg/L,Fe=50 mg/L; and it was found that Mo had the largest effect on phosphate reducing bacteria,followed by Ni,Co and Fe.

phosphate reducing bacteria; phosphorus concentration; microelement

2019-11-14

谭舒波（1994-），女，辽宁省阜新市人，毕业于沈阳建筑大学环境工程专业，研究方向：污水处理。

X703.1

A

1004-0935（2020）03-0238-05