高尔基体蛋白73对抗病毒治疗慢性乙型肝炎患者代偿期肝硬化的诊断价值

刘沁雨，常 越，张 青，丁玉平，李 海

慢性病毒性肝炎是目前全球范围内引起肝脏疾病的主要病因，其中乙型病毒性肝炎对中国乃至东南亚的威胁尤为严重[1]。根据流行病学统计，2015年全球范围内约有3.5%人口HBsAg检测为阳性，慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B, CHB)患者高达2.57亿。肝脏疾病常由肝炎进展至肝纤维化、肝硬化，后继续发展成为不可逆的肝衰竭、肝细胞癌等终末期疾病，仅2015年全球因乙型肝炎病毒感染而导致的相关死亡人数达88.7万[2]。因此，早期发现CHB临床疾病进展风险有助于改善患者预后，但因肝脏疾病进展较为隐匿，除肝活检这一金标准外目前临床缺乏准确高效的检测手段。国内外多项研究表明，血清学检测指标高尔基体蛋白73(Golgi protein 73, gp73)对肝硬化具有较优的诊断价值[3]；同时还有研究学者发现，人尾肢同源蛋白2(people end limb homologous protein 2, pygo2)对肝硬化也具有一定的诊断价值[4]；但二者对已进行长期抗病毒治疗的CHB患者是否具有相同诊断价值目前尚不明确。因此，本研究选取具有2年以上抗病毒治疗的CHB代偿期肝硬化患者，探究gp73与pygo2对CHB代偿期肝硬化的诊断效能，旨在寻找更有效的无创检测指标。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2019年1月—6月于中国人民武装警察部队特色医学中心及天津市西青医院就诊CHB患者的一般资料，经筛选共85例患者入组，其中男57例，女28例;年龄(50.55±10.50)岁。根据诊断标准，同时结合临床表现及检查结果，将入选CHB患者分为肝炎组51例和代偿期肝硬化组34例。①纳入标准：所有患者HBsAg阳性超过6个月；均符合《慢性乙型肝炎防治指南(2015年版)》中相关CHB或CHB代偿期肝硬化诊断标准[1]；均规律服用核苷(酸)类似物抗病毒药物超过2年；年龄18～75岁。②排除标准：除CHB外合并其他肝脏炎症疾病者；伴有心、脑、肺、肾等重要脏器损伤者；未能长期按说明书规律服用抗病毒药物者；伴有恶性肿瘤者；研究人员认为患者因各种原因无法完成本研究者。所有患者均已知晓本研究目的及意义，并签署知情同意书，且本研究已获医院伦理委员会批准。

1.2方法

1.2.1基本资料采集：收集患者的一般资料如性别、年龄，临床实验室检测生化指标，包括总胆红素(total bilirubin, TBil)、丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotransferase, AST)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-glutamyl transpeptidase, GGT)、血小板计数(platelet count, PLT)。生化指标采用西门子全自动样品处理系统测定，PLT采用血液细胞分析仪(型号：希森美康xs-1000i)进行测定。同时收集患者影像学指标，包括腹部彩超和FibroScan(型号：FibroScan502)，主要分析患者肝硬度测定(liver stiffness measurement, LSM)值。LSM值测定需至少成功10次，取中位数，同时需满足四分位间距与中位数的比值<0.3[5]。

1.2.2血清gp73和pygo2蛋白检测：收集患者采血当日血液离心后的上层血清，至少0.5 ml，并冻存于-80℃冰箱保存。血清gp73和pygo2蛋白浓度测定均按照试剂盒(gp73试剂盒购自海南众森生物科技有限公司，pygo2试剂盒购自Abbexa Ltd.)提供的说明书严格进行，测定方法采用标准酶联免疫吸附实验法。样本于2019年8月进行统一测定，全部检测指标均重复测量3次，确保无异常数值后选定为最终实验结果。

1.2.3基于4因子的纤维化指数(fibrosis index based on the 4 factors, FIB-4)诊断模型：计算公式：FIB-4=(年龄×AST)/(PLT×ALT1/2)[6]

1.2.4天冬氨酸转氨酶和血小板比率指数(aspartate aminotransferase-to-platelet ratio index, APRI)诊断模型：计算公式：APRI=(AST/AST正常参考值上限)×100/PLT(109/L)[6]

2 结果

2.1试剂盒效能检测 本研究中gp73酶联免疫吸附实验试剂盒检测范围为1.00～475.00 ng/ml，pygo2为1.00～10.00 ng/ml，gp73和pygo2蛋白检测结果均在上述范围内；多次实验所得标准曲线相关系数r均大于0.99，线性系数良好；批内或批间重复性测量变异系数均小于15%。

2.2基本资料比较 经K-S检验和方差齐性检验后发现年龄符合正态分布(P>0.05)，且方差齐(P>0.05)；其他数据不符合正态分布(P<0.05)。进一步分析发现，代偿期肝硬化组TBil、ALP、GGT、APRI、FIB-4、LSM值明显高于肝炎组，PLT明显低于肝炎组(P<0.05)。2组性别、年龄、ALT和AST比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 2组CHB患者的基本资料比较

注：CHB为慢性乙型肝炎，TBil为总胆红素，ALT为丙氨酸转氨酶，AST为天冬氨酸转氨酶，ALP为碱性磷酸酶，GGT为γ-谷氨酰转肽酶，PLT为血小板计数，LSM为肝硬度测定，FIB-4为基于4因子的纤维化指数，APRI为天冬氨酸转氨酶和血小板比率指数

2.3gp73和pygo2蛋白浓度比较 将2组的gp73和pygo2蛋白浓度进行箱型图绘制，可见2种蛋白浓度呈非正态分布。见图1和2。其中代偿期肝硬化组的gp73和pygo2蛋白浓度分别为(16.62±15.48)ng/ml和(0.73±1.01)ng/ml，肝炎组的gp73和pygo2蛋白浓度分别为(1.65±1.56)ng/ml和(1.13±2.23)ng/ml。代偿期肝硬化组的gp73蛋白浓度明显高于肝炎组(P<0.05)；而2组的pygo2蛋白浓度比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4gp73和pygo2蛋白对CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值 将gp73和pygo2蛋白进行ROC曲线绘制，结果显示gp73的AUC=0.926，pygo2的AUC=0.503，可见gp73对抗病毒治疗CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值明显优于pygo2。gp73最佳诊断点为2.7 ng/ml，敏感度91.2%，特异性86.3%；pygo2最佳诊断点为0.3 ng/ml，敏感度与特异性分别仅为50.0%、56.9%。见图3。

图1 2组CHB患者的gp73蛋白浓度比较

CHB为慢性乙型肝炎，gp73为高尔基体蛋白73；与肝炎组比较，aP<0.05

图2 2组CHB患者的pygo2蛋白浓度比较

CHB为慢性乙型肝炎，pygo2为人尾肢同源蛋白2

图3 gp73和pygo2蛋白对抗病毒治疗CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值

CHB为慢性乙型肝炎，gp73为高尔基体蛋白73，pygo2为人尾肢同源蛋白2

2.5常规无创诊断方法对CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值 将入组患者APRI、FIB-4、LSM值、gp73和pygo2蛋白同时进行ROC曲线的绘制，结果显示gp73的AUC=0.926、LSM值的AUC=0.757、FIB-4的AUC=0.742、APRI的AUC=0.713、pygo2的AUC=0.503。可见gp73对抗病毒治疗CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值优于其他常规无创诊断模型。见图4。

图4 常规无创诊断方法对抗病毒治疗CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值

CHB为慢性乙型肝炎，LSM为肝硬度测定，FIB-4为基于4因子的纤维化指数，APRI为天冬氨酸转氨酶和血小板比率指数，gp73为高尔基体蛋白73，pygo2为人尾肢同源蛋白2

3 讨论

目前，慢性病毒性肝炎是全球性健康问题，也是我国及东南亚地区面临的主要公共卫生问题之一，若不加以控制，患者易进展至终末期肝脏疾病。相较于丙型肝炎，乙型肝炎的治疗仍存在一定局限性，目前常口服核苷(酸)类似物进行抗病毒治疗[7]。随着抗病毒药物的研发以及患者对CHB认识的深入，CHB患者基本能够做到长期规律服用药物。但有研究表明，即便长期服用抗病毒药物，仍有部分患者可进展至失代偿期肝硬化甚至肝细胞癌[8]。由于肝脏疾病进展存在一定的隐匿性，患者及临床医生不易察觉，当出现明显临床症状时肝脏已进展至不可逆时期。因此，对于抗病毒治疗的CHB患者仍应该做到规律复查，对代偿期肝硬化早发现、早治疗。由于诊断金标准肝脏病理活检存在一定不可重复性，无创诊断技术成为筛查CHB患者病情进展的主要手段[9]。目前，FibroScan及血清学指标是较为常见的诊断技术，但都存在特异性和敏感性不高，易受其他因素影响等缺点[10]。近年来肝脏特异蛋白成为学者研究的热点，本研究选取gp73和pygo2蛋白进行研究，分析比较上述蛋白对抗病毒治疗CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值。

我国于1999年开始应用核苷(酸)类似物治疗CHB，经多年临床观察，绝大部分患者具有较高的依从性，获得了较理想的抗病毒疗效，同时药物严重不良反应出现概率较小。本研究选取85例CHB及CHB代偿期肝硬化患者为研究对象，入组患者都已长期规律服用抗病毒药物2年以上，病情较为稳定。经分析比较发现，肝炎组和代偿期肝硬化组的ALT和AST比较无明显差异，这可能是由于长期服用抗病毒药物，肝脏无明显急性炎症。但因代偿期肝硬化组为早期肝硬化患者，存在一定程度的肝脏慢性损伤，同时可能伴有进行性肝纤维化，GGT对此反应较为敏感[11]，故代偿期肝硬化组GGT明显高于肝炎组。ALP主要分布于肝细胞的血窦侧及毛细胆管的微绒毛上，因此代偿期肝硬化组ALP高于肝炎组可能与肝硬化引起胆汁排出不畅，毛细胆管内压增高而诱发ALP大量释放有关[12]。同时本研究结果显示，代偿期肝硬化组TBil高于肝炎组，表明代偿期肝硬化患者存在一定的胆汁淤积现象。另外，代偿期肝硬化组PLT明显低于肝炎组，这可能是由于肝硬化患者常伴有脾功能亢进，同时乙型肝炎病毒对血小板生成具有一定的抑制作用[13]。故即便长期规律服用抗病毒药物，代偿期肝硬化患者肝脏功能受损情况仍然较重，因此早期发现疾病进展、及早进行有效治疗有助于改善患者预后。

gp73于2000年由Kladney等[14]在成人巨细胞肝炎差异表达蛋白的基因筛选中被鉴定出来，后续进一步研究发现此蛋白在正常肝细胞中不表达，而在各种原因所致的肝硬化患者中高度表达。同时有研究还指出，肝硬化患者即便出现肝细胞比例下降情况，但肝细胞中gp73的表达量仍可超过整个肝组织水平，故高表达量gp73可能在肝病的细胞途径中发挥重要作用[15]。同样pygo2蛋白作为一种较新型的蛋白指标，是wnt信号通路的主要效应蛋白，而wnt信号通路能通过促进细胞外基质的沉积、活化肝星状细胞等，进一步引起肝纤维化的发生[16-17]。本研究结果发现，代偿期肝硬化组gp73蛋白浓度明显高于肝炎组，而2组pygo2蛋白浓度比较差异无统计学意义。再通过建立ROC曲线进一步分析2种蛋白对CHB患者代偿期肝硬化的诊断价值发现，gp73的AUC可高达0.926，而pygo2的AUC仅为0.503。这进一步说明在本研究中gp73具有较优的诊断效能，可能更适合对长期抗病毒治疗的CHB患者进行筛查，特别是gp73浓度超过2.7 ng/ml时应警惕代偿期肝硬化的发生。本研究结果与姚明解等[3]和张丽君等[18]的研究结果相似。同样Morota等[19]对美国人群的研究中也发现，gp73浓度在肝硬化患者中明显高于肝炎患者。目前，国内外对于pygo2的研究相对较少，国内朱传龙等[4]、Li等[16]和李毓雯等[20]学者分别对慢性丙型肝炎、CHB和非酒精性脂肪性肝炎进行pygo2浓度测定发现，随着肝纤维化程度加重pygo2浓度也随之升高。本研究未能得出上述相应结果，进一步分析可能有以下原因：①有无抗病毒治疗史：本研究入组患者全部进行超过2年的有规律抗病毒治疗，可能对pygo2的测定产生一定影响；②入组患者存在南北方地域差异：本研究入组患者为天津及周边患者，多为北方人，而Li等[16]研究患者多为安徽、江苏等南方患者，由于存在一定地域跨度可能对pygo2检测造成影响；③入组患者年龄差距：本研究入组患者多为50岁以上患者，而Li等[16]的研究患者多为30岁左右的患者；④肝硬化程度不同：本研究入组肝硬化患者为代偿期，而Li等[16]除纳入肝硬化患者外也将肝纤维化患者纳入进行比较，同时对于肝硬化患者并未明确阐述其是否为代偿期。目前，相较于诊断价值已被国内外多项研究证实的gp73，pygo2相关研究尚少，特别是对CHB肝硬化仍需大样本多中心数据进一步支持。

目前无创诊断技术趋于成熟，相较于肝脏病理活检这一有创检测，其更具有可持续性、易重复测量、价格经济、患者接受度高等优点[21]。无创诊断技术主要包括血清学和影像学检测，其中如APRI、LSM值等指标已被国内外各大指南推荐用于疾病的初筛及长期监测[22-23]。本研究选取其中有代表性的APRI、FIB-4和LSM值与2种蛋白进一步比较，结果显示gp73对于进行长期抗病毒治疗CHB患者肝硬化的诊断价值最高，影像学LSM值优于FIB-4和APRI，但pygo2诊断价值明显低于上述4种无创诊断指标。故gp73适用于诊断进行长期抗病毒治疗CHB患者的代偿期肝硬化，而pygo2还需后续大样本数据进一步研究证实。本研究基于真实世界研究，因入组患者意愿等情况，未能对所有入组患者进行肝脏病理活检，无法明确入组患者肝脏炎症及纤维化情况。由于研究经费等原因，pygo2试剂盒数量及入组患者人数有限，未能进行大样本多人群的pygo2检测。基于上述不足，还要继续收集不同疾病进展时期乙型肝炎病毒感染患者的临床数据，进一步研究分析gp73和pygo2的诊断效能。本研究结果显示gp73浓度超过2.7 ng/ml可能预示CHB患者将或已发展成为代偿期肝硬化，此时肝硬化具有逆转的可能性，应采取积极有效的治疗手段，改善患者预后。本研究结果显示，pygo2对进行长期抗病毒治疗CHB患者肝硬化的诊断价值相对较低，其临床价值还有待进一步研究证实。