RNA干扰免疫蛋白酶体对缺血性脑卒中大鼠梗死面积及炎性反应的影响

王 丹

缺血性脑卒中主要是由于颈动脉、椎动脉狭窄或闭塞所致脑供血不足，最终引起脑组织坏死的疾病[1]。在临床上对缺血性脑卒中的治疗旨在阻止脑缺血发展，减轻脑损伤，根据患者不同病因、病情等制定治疗方案，进行个体化治疗。目前，在临床上没有治疗脑卒中的特效药物，多数患者需要长期用药治疗与护理，故脑卒中发病机制研究对临床治疗具有重要意义[2]。泛素-蛋白酶体系统是真核细胞体内蛋白质降解体系，能够清除受损蛋白以及错误折叠蛋白，调节细胞内蛋白水平，维持细胞内环境稳态平衡，同时也参与细胞周期、凋亡、翻译、转录、免疫应答等多种细胞生理进程[3]。低分子量多肽2(LMP2)是免疫蛋白酶体20S的β亚单位，能够促进蛋白酶体产生，增强与组织相容性抗原结合多肽的能力，还能够促进淋巴细胞存活[4]。有实验研究发现，LMP2沉默可以改善脑缺血大鼠血脑屏障的通透性[5]。本研究通过RNA干扰技术下调LMP2表达，发现RNA干扰LMP2预处理可以改善缺血性脑卒中大鼠的脑梗死情况与炎性反应。具体内容报告如下。

1 材料与方法

1.1实验试剂与仪器 兔抗鼠Caspase-3抗体(9662P，上海北诺生物科技有限公司)，兔抗鼠脑源性生长因子(BDNF)、酪氨酸激酶受体B(TrkB)、核因子-κB(NF-κB)p65抗体(上海恒斐生物科技有限公司)，TUNEL试剂盒(KGA702C，上海优予生物科技有限公司)，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒(K4754-100，艾美捷科技有限公司)、白介素-1β(IL-1β)ELISA试剂盒(YM-QP10189，上海远慕生物科技有限公司)，RNA干扰病毒载体LMP2-shRNA及NC-shRNA(上海吉凯基因化学技术有限公司构建及鉴定)。电凝器(200B，四川科仪诚科技有限公司)，正置荧光显微镜(DFM-20C，上海蔡康光学仪器有限公司)，全自动轮盘式切片机(KD-2258，北京佳源兴业科技有限公司)。

1.2实验动物 选取SPF级健康雄性4周龄SD大鼠44只，体重为240～260 g，购于南方医科大学，许可证号：SCXK(粤)2016-0041。购回适应饲养1周，饲养环境温度为20～25℃，湿度为50%～55%，人工光照12 h，自由饮水。在本实验中对动物的处置均严格遵守《关于善待实验动物的指导性意见》的规定。

1.3实验分组与模型制备 采用线栓法制备缺血性脑卒中大鼠模型，手术前禁食12 h。将SD大鼠分为假手术组12只、模型组16只以及RNA干扰组16只，将模型组和RNA干扰组大鼠，腹腔注射1%戊巴比妥钠3 ml/kg进行麻醉，麻醉成功后消毒，切皮钝性分离左侧颈总动脉、翼腭动脉、颈内动脉、颈外动脉，结扎翼腭动脉，在距离颈总动脉分叉10 mm处结扎颈外动脉，采用电凝器灼断颈外动脉远心端，采用尾静脉夹夹闭左侧颈总动脉，于结扎颈外动脉距离近心端5 mm处，剪一切口，颈外动脉近心端、颈内动脉牵拉为直线。将生理盐水预处理过的线栓由左侧颈外动脉主干切口向颈内动脉入颅方向缓慢插入，当距分叉口18～20 mm时，有轻微阻力，表示线栓处于大鼠大脑中动脉且大脑中动脉已阻断，固定线栓，阻断2 h后再灌注，将线栓回抽至颈动脉分叉处，常规缝合伤口。假手术大鼠操作只进行至分离动脉，不进行结扎和凝闭、不插线栓，伤口缝合等方式与模型组和RNA干扰组相同。造模成功标准：大鼠反应迟钝，行走出现向右转圈或者倾斜，倒悬空时右侧上肢屈曲。模型组和RNA干扰组造模过程中各死亡2只，另外模型组造模不成功2只，RNA干扰组造模不成功1只。

1.4干预方法 于造模前1 h，采用微量进样器将10 μl NC-shRNA、10μl LMP2-shRNA慢病毒载体分别注入模型组和RNA干扰组大鼠侧脑室内，定位方法参考文献[6]。于术后、再灌注12、24和48 h时分别进行神经功能评分、炎性因子水平检测。各组分别于再灌注48 h时，麻醉处死大鼠，取出脑组织，用于观察脑组织梗死情况，其中一部分脑组织用于炎性因子检测、TUNEL检测，另一部分脑组织存储于-80℃环境待测。

1.5神经功能评分 采用Longa的5级评分法对各组术后、再灌注12、24和48 h的神经功能进行评定。无神经缺损症状记0分，不能伸展右侧前爪记1分，行走时向右侧转圈记2分，行走时向右侧倾倒记3分，不能自发行走、意识丧失则记4分。

1.6TNF-α、IL-1β含量检测 取各组术后、再灌注12、24和48 h时的静脉血各1 ml，1500 r/min离心10 min，取上层血清存储于-80℃冰箱，采用ELISA法检测血液中TNF-α、IL-1β水平。待各组再灌注48 h静脉采血后，麻醉处死大鼠，将脑组织加入组织细胞裂解液与蛋白酶抑制剂，研磨成匀浆，3000 r/min离心20 min，取上层清，用于脑组织TNF-α、IL-1β含量的ELISA检测。所有实验操作严格参照试剂盒说明进行。

1.7脑梗死情况检测 各组再灌注48 h后，取出完整脑组织，于-20℃冰箱中速冻15 min，专用脑槽进行冠状切片层厚2 mm，再将脑片置于2%TTC溶液中，37℃恒温水浴避光25 min，PBS清洗3次，甲醛固定24 h，整理脑片，进行图像采集。采用Image J软件对大鼠脑梗死面积进行数据收集。脑组织呈现出红色表示为正常的脑组织，脑组织呈现出白色为脑梗死组织，脑梗死体积(mm3)=各层面梗死面积总和×各层厚度，脑梗死体积百分比=脑梗死体积/半球总体积×100%。

1.8TUNEL检测 将脑组织置于4%多聚甲醛中固定，常规石蜡包埋切片，采用TUNEL法观察脑组织细胞凋亡情况，实验步骤严格按照TUNEL试剂盒说明书操作，在显微镜下观察并采集图像。随机选取5个视野，记录每个视野100个细胞中的阳性细胞数，计算5个视野的阳性细胞数均值作为该组的阳性细胞数。

1.9Western-blot检测 提取各组大鼠脑组织总蛋白，采用Bradford调节蛋白浓度、SDS-PAGE电泳、电转至PVDF膜，密封2 h，加入BDNF、TrkB、NF-κB p65、GAPDH一抗(1∶500)4℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)孵育1 h，按照ECL试剂盒操作说明进行显影，收集影像。

2 结果

2.1神经功能评分比较 采用Longa评分法对各组术后、再灌注12、24和48 h的神经功能进行评定。结果显示，在相同时间点时，模型组和RNA干扰组的神经功能评分均高于假手术组，模型组在再灌注12、24和48 h的神经功能评分高于RNA干扰组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠的神经功能评分比较分)

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

2.2血液炎性因子水平比较 采用ELISA法检测各组大鼠术后、再灌注12、24和48 h血液TNF-α、IL-1β含量。结果显示，在相同时间点时，模型组和RNA干扰组血液TNF-α、IL-1β含量均高于假手术组，模型组在再灌注12、24和48 h时血液TNF-α、IL-1β含量高于RNA干扰组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表2和3。

表2 3组大鼠血液TNF-α水平比较

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

表3 3组大鼠血液IL-1β水平比较

注：IL-1β为白介素-1β；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

2.3脑组织炎性因子水平比较 大鼠再灌注48 h后，麻醉处死大鼠，取脑组织制备成匀浆，离心取上清，ELISA法检测3组脑组织TNF-α、IL-1β水平。结果显示，模型组和RNA干扰组脑组织TNF-α、IL-1β含量均高于假手术组，模型组脑组织TNF-α、IL-1β含量高于RNA干扰组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表4。

2.4大鼠脑梗死情况比较 待3组再灌注48 h后，麻醉处死大鼠，取出完整脑组织，TTC法检测各组脑梗死情况，TUNEL法检测各组脑组织细胞凋亡情况。结果显示，模型组和RNA干扰组脑梗死体积百分比、阳性细胞数均高于假手术组，模型组脑梗死体积百分比、阳性细胞数高于RNA干扰组，差异均有统计学意义(P<0.05)，见图1和表5。

表4 3组大鼠脑组织TNF-α和IL-1β水平比较

注：TNF-α为肿瘤坏死因子-α，IL-1β为白介素-1β；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

图1 脑组织凋亡细胞的TUNEL检测结果(bar=50 μm)

表5 3组大鼠脑梗死体积百分比和阳性细胞数目比较

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

2.5脑组织BDNF、TrkB、NF-κB p65、Caspase-3水平比较 采用Western-blot检测再灌注48 h后脑组织中BDNF、TrkB、NF-κB p65、Caspase-3水平。结果显示，与假手术组比较，模型组和RNA干扰组脑组织中BDNF、TrkB含量降低，NF-κB p65、Caspase-3水平升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；与模型组比较，RNA干扰组BDNF、TrkB含量升高，NF-κB p65、Caspase-3水平降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图2和表6。

图2 3组大鼠脑组织BDNF、Trk B、NF-κB p65、Caspase-3凝胶成像结果

1为假手术组，2为模型组，3为RNA干扰组；BDNF为脑源性生长因子，TrkB为酪氨酸激酶受体B，NF-κB为核因子-κB

表6 3组大鼠脑组织BDNF、TrkB、NF-κB p65、Caspase-3水平比较

注：BDNF为脑源性生长因子，TrkB为酪氨酸激酶受体B，NF-κB为核因子-κB；与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，cP<0.05

3 讨论

缺血性脑卒中也称为脑梗死、中风，其发病率高、致残率高、病死率也高，是严重威胁人类生命安全的疾病之一[7-8]。缺血性脑卒中占脑卒中病例数的60%～80%，临床症状多样，发病机制复杂，导致临床治疗较困难[9]。目前，主要通过制备动物模型，模拟临床脑卒中患者来对缺血性脑卒中的发病机制进行研究[10]。泛素-蛋白酶体系统主要包括泛素系统和26S蛋白酶体，20S蛋白酶体是26S蛋白酶体的核心结构，LMP2是构成20S蛋白酶体的活性单位之一，具有水解谷氨酰基肽活性[11-12]。已有研究显示，去泛素酶、小分子抑制剂以及泛素-蛋白酶体降解的蛋白质对缺血性脑血管病均表现出神经保护作用[13-14]。本研究通过线栓法建立缺血性脑卒中大鼠模型，探究RNA干扰LMP2预处理对缺血性脑卒中大鼠脑组织损伤的影响。

本研究结果显示，RNA干扰组术后神经功能评分显著低于模型组，表明RNA干扰LMP2预处理可以减轻缺血性脑卒中大鼠神经功能损伤。脑缺血性神经功能损伤主要是由于局部脑组织供血和供氧不足导致的脑损伤，由此推断RNA干扰LMP2可能降低缺血性脑卒中大鼠的脑损伤。脑梗死直接影响脑功能状态，本研究结果显示，当缺血再灌注48 h后，模型组与RNA干扰组均出现脑梗死情况，并且RNA干扰组的脑梗死体积百分比显著降低，同时TUNEL检测结果也显示，RNA干扰组脑组织阳性细胞数目、Caspase-3水平显著低于模型组。机体缺血缺氧损伤时，线粒体膜结构受到破坏，诱导细胞凋亡因子进入细胞基质，激活Caspase级联反应并启动细胞凋亡程序，激活Caspase-3活性，使脑细胞发生凋亡[15]。脑缺血时，蛋白酶体抑制剂可以减轻神经细胞、星形胶质细胞变性，缩小脑皮质梗死体积。而且20S蛋白酶体可以降解特异性蛋白，促进细胞死亡。由此推测，RNA干扰LMP2预处理可以减轻缺血性脑卒中大鼠的脑梗死体积，保护大鼠神经功能，可能与降低缺血脑卒中大鼠脑组织中Caspase-3水平有关。

当发生缺血缺氧时，脑组织中的氧在短时间内消耗完毕，ATP合成出现障碍，影响ATP依赖性蛋白酶体蛋白水解功能，泛素化蛋白累积，引起神经细胞凋亡，发生神经功能障碍[16]。缺血缺氧后会激活机体炎性反应，炎性因子水平增加会增强氧化应激反应，使细胞膜结构破坏，促进细胞凋亡。本研究结果显示，RNA干扰LMP2预处理可以降低大鼠脑缺血再灌注后血液TNF-α、IL-1β水平以及再灌注48 h后脑组织TNF-α、IL-1β、NF-κB p65水平。TNF-α、IL-1β均参与机体炎性反应，NF-κB是调节炎性反应的重要转录因子，含有2个亚基蛋白(p50与p65)，其磷酸化可以使神经元细胞膜NF-κB p65/p50转录移位，诱导炎性因子合成增多，放大炎性反应，引起细胞凋亡[17-18]。有学者认为，蛋白酶体可以直接激活NF-κB，介导缺血后自由基氧化损伤，增强组织功能损伤[19]。由此推测，RNA干扰LMP2预处理可以降低缺血性脑卒中大鼠机体炎性反应，可能与影响NF-κB信号通路有关。本研究结果还发现，RNA干扰LMP2预处理可以增加缺血性脑卒中大鼠再灌注48 h后BDNF、TrkB水平。BDNF在脑神经功能修复、功能维持等过程中具有重要作用，TrkB是其特异性受体，BDNF/TrkB磷酸化可以促进神经细胞修复。由此表明，RNA干扰LMP2预处理可以增强缺血性脑卒中大鼠神经功能修复，可能与影响BDNF/TrkB信号途径有关，但其中具体作用机制，尚不清楚。

综上所述，RNA干扰LMP2预处理可以降低TNF-α、IL-1β以及NF-κB p65水平，降低机体炎性反应，可能与影响NF-κB信号通路有关；还可以增加BDNF、TrkB水平，降低Caspase-3含量，从而减少脑组织损伤，保护神经功能，可能与影响BDNF/TrkB信号途径有关，但其中分子作用机制还需要进一步研究。