烟碱龙胆酸盐的制备、表征和缓释性能研究

杨继，吴亿勤，杨柳，雷萍，高茜，申钦鹏，段沅杏，赵杨，陈永宽*，张双双，杜巧红，李晖

1 云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市北市区红锦路367号 650231；2 四川大学化学工程学院，成都市武侯区一环路南一段24号 610065

烟碱是烟叶中天然生物碱的主要化学成分，分子结构（图1a）是由两个氮杂环构成，吡咯环pKa=7.87，吡啶环pKa=3.15。吡啶环中的氮原子由于芳香化的影响，碱性很弱，与芳胺的碱性相近。吡咯烷环中的氮原子属于叔胺，由于此环没有芳香化，其碱性与脂肪族叔胺碱性相近，所以，烟碱易和酸进行化学反应。已有报道指出，烟碱在烟叶中主要以柠檬酸、苹果酸等有机酸盐的形式存在[1]；烟碱与硅钨酸作用生成烟碱硅钨酸[2]。这些结果说明，合成烟碱的有机酸盐，代替单体烟碱，用于制品配方，研发新型烟草制品的技术路线是可行的。而且结合态的烟碱不仅可以改善口感，而且影响烟碱的溶出行为，能持续提供生理满足感和口感。最近，据《国际烟草》和烟业通讯网报道，美国帕克斯实验室推出一款新的智能电子烟，该电子烟是以“尼古丁盐”为核心原料，而非传统电子烟中游离态的烟碱。美国杜克大学Jed E. Rose 教授成功合成了烟碱丙酮酸盐，并进行了相关药代动力学方面的研究[3]。同时，有关烟碱酒石酸盐[4]，水杨酸和烟碱共晶体的相关研究也有报道[5]。烟碱与有机酸成盐，使得烟碱以固态形式存在，相较于易挥发且易被氧化的烟碱单体[6]，固体烟碱盐具有良好的储藏稳定性。烟碱的不同存在形式（包括烟碱盐），对烟碱的释放以及跨膜渗透速率有不同的影响[7]。有研究表明，质子态的烟碱相较于中性游离态烟碱，由于分配系数以及扩散率更小，在口腔粘膜中的渗透速率小[8]；烟碱的质子化可以减缓烟碱的透膜扩散，改善烟碱在体内的代谢行为[9]。因此，利用固体有机酸固化液态烟碱，形成烟碱的固态盐形式，可以作为新的烟碱引入形式，应用于新型烟草制品的研发。

龙胆酸（gentisic acid），即2, 5-二羟基苯甲酸（图1b），是一种多羟基酸，具有解热镇痛的功效[10]，也用作医药中间体，易与碱性物质成盐。本文利用化学合成方法，制备烟碱龙胆酸盐，培养单晶体，解析其其结构。将制备的烟碱龙胆酸盐作为模型分子，利用药物透皮扩散技术，以离体猪口腔颊黏膜为载体，研究了不同酸碱度下烟碱龙胆酸盐的跨膜扩散行为，并和纯烟碱进行了对比，对其烟碱的释放规律进行了探究。本研究可为无烟制品配方设计、改进及应用提供实验和理论参考。

图1 （a）烟碱分子结构（b）龙胆酸分子结构Fig.1 (a) Molecular structure of nicotine (b) Molecular structure of gentian acid

1 实验部分

1.1 试剂及仪器

1.1.1 试剂

烟碱标准从由陕西港华生物科技有限公司购置，纯度99%（HPLC 纯度）；龙胆酸（纯度99%）由成都市科龙化工试剂厂购置；甲醇（色谱纯）由德国默克密理博试剂公司购置；其他所用试剂均为分析纯。水为高纯水，由Millipore Synergy 超纯水系统制备。

1.1.2 仪器

X- 射线单晶衍射仪：CCDX-caliburNova 型，牛津衍射有限公司；高效液相色谱仪：Agilent 1200 series（美国安捷伦科技有限公司）；pH 计：上海精密科学仪器有限公司；METTLER TOLEDO 分析天平：感量0.0001 g，德国METTLER TOLEDO 公司；13 mm×0.45 µm 水相针式滤器：上海安谱科学仪器有限公司；HY-8 调速振荡器：常州国华电器有限公司；KQ-700DE 型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。Milli-Q50 超纯水仪：美国MILLIPORE 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 烟碱龙胆酸盐的制备

取0.95 g 龙胆酸于锥形瓶中，加入5 mL 乙醇使其完全溶解，再加入15 mL 的超纯水，搅拌至混合均匀。对锥形瓶进行遮光处理后，置于恒温搅拌器中，在充分搅拌下滴加1.01 g烟碱，控制反应温度为35 ℃，30 min 滴加完毕。控制溶液pH 在5.5～6.0 之间搅拌至反应结束。

过滤反应后所得溶液，将滤液置于常温避光处静置24 h 后，溶液转移至真空干燥箱。在温度35℃、真空度0.8 MPa 条件下进行真空干燥，一周后得到棕黄色粘稠液体。黄色粘稠液体在常温避光下进行晶体培养，数周后得到棕黄色透明针状晶体。

1.2.2 单晶结构测定

选择尺寸大小合适的棒状晶体，利用CCD Xcalibur E 型X-射线单晶衍射仪（瑞士Bruker 公司）进行X-射线单晶衍射测试。MoKα 辐射，λ = 0.71073，293K，θ 扫 描 范 围3.13-26.37°。Olex2-1.1 （SHELX-97）软件包用于结构解析与精修。

1.2.3 烟碱定量分析方法

准确移取50 µL 烟碱标准品于5.0 mL 棕色容量瓶，用超纯水稀释，超声处理约2.0 min 后准确定量至5.0 mL，制备成烟碱浓度为101 mg/mL 的储备液。配制烟碱系列浓度，检测波长设定为259 nm，瑞典Kromasil C18 色谱柱（250×4.6 mm i.d），绘制工作曲线。线性关系为：y=10786.1x-69.9，R2=0.9999。测定烟碱龙胆酸盐中烟碱含量测定时，准确称取所制备的烟碱龙胆酸盐5.08 mg，于5.0 mL 带塞的棕色容量瓶中，滴加适量3 次蒸馏水使其溶解。超声约10 min 后，用3 次蒸馏水定容至刻度，摇匀得浓度分别为1.016 mg/mL 的烟碱龙胆酸盐样品溶液。分析前经0.45 μm 微孔滤膜过滤后，直接进样测定。

1.2.4 跨膜扩散实验样品制备

人工模拟口腔唾液配方见表1，准确称取表1 中各物质，溶于1L 超纯水中，待溶解完全后即得模拟唾液储备液。分别取一定量模拟唾液储备液，用稀盐酸调节pH，调至pH=6.7 和pH=5.5，得到pH 分别为6.7 和5.5 的模拟唾液储备液。准确取烟碱200 mg 两份以及当量的烟碱龙胆酸盐（452 mg）两份，分别用对应pH 的模拟唾液储备液溶解，加入一定量稀盐酸使得最终定容后溶液pH 为6.7 和5.5，并用对应pH的储备液定容于100 mL 容量瓶，得到pH 分别为6.7和5.5 的2 mg/mL 烟碱储备液和烟碱龙胆酸盐储备液。准确取烟碱100 mg 两份以及当量的烟碱龙胆酸盐（226 mg）两份，分别用对应pH 的模拟唾液储备液溶解并定容于100 mL 容量瓶，并加入微量稀盐酸调节其pH 至6.7 和5.5，得到pH 分别为6.7 和5.5的1 mg/mL 烟碱储备液和烟碱龙胆酸盐储备液。

1.2.5 烟碱龙胆酸盐跨膜扩散实验

统一选取体质量为（110±5） kg 的健康生猪进行口腔颊黏膜采集。选取当天屠宰且未经开水烫过的新鲜猪首，剪下猪首口腔中颊膜连带肌肉组织，剥离皮下脂肪层和结缔组织，获得约4×4 cm2大小的颊黏膜。选取光滑正常（未出现红肿、溃疡等病态）且表面干净无异物的口腔粘膜，用生理盐水冲洗2 次后，浸泡在生理盐水中，并做好标记。采集的颊黏膜厚度通常在2.0～3.0 mm 之间，如图2 所示，实验前对黏膜不光滑一侧进行再次切割，使得黏膜厚度控制在（1.0±0.1） mm。每次实验均使用新鲜的猪口腔颊黏膜，为保证的实验一致性，实验前离体时间控制在（6 ± 0.5） h，并且为保持其活性，用Krebs 液平衡1.5 h[11]。Krebs 液是一种用于模拟生理条件的体外营养液或灌流液[12]，其组成见表1。

图2 采集的猪口腔颊粘膜Fig.2 Buccal mucosa of pig mouth

表1 Krebs 液配方Tab.1 Formula of Krebs solution

采用TP-6 型药物透皮扩散试验仪进行烟碱的跨口腔黏膜扩散研究。实验过程中，将采集的新鲜猪口腔颊黏膜夹在扩散池（供给池）与接受池之间，光滑的颊膜外侧朝向烟碱供给池，有褶皱颊膜内侧表面沉浸在接受介质中[9,11]。准确移取6 mL 样品储备液（烟碱单体储备液、烟碱龙胆酸盐储备液）置于扩散池，6 mL 具有相同pH 的空白模拟唾液置于接受池，在（37±0.5）℃，磁力搅拌转速350 rpm 下进行跨膜扩散实验。在时间梯度为（0，2，4，6，8，10，12，15，20，30，40，50，60 min）下，从接受池中抽取500 µL 样品溶液，并补加相应体积相同pH 的模拟唾液介质。每一组对照实验同时进行，12 组平行实验分12 批进行。在进行烟碱样品的跨膜扩散实验时，同步进行扩散池中无烟碱的空白实验，以最大程度排除猪口腔黏膜在扩散过程中释放的物质对烟碱含量测定的影响。按1.2.3 测得烟碱浓度,代入下式计算烟碱累积渗透量Q（mg/cm2）[13-14]：

式中Q 为累积透过量（µg/cm2）；V 为接受池中接收液的体积（mL）；Cn为第n 个取样点测得的药物质量浓度（µg/mL）； S 为有效扩散面积（cm2）（本研究中S=3.14 cm2）。

以药物累积渗透量Q 为纵坐标，以时间t 为横坐标作图,可以得到烟碱累积渗透量与扩散时间的关系图。对所得数据进行线性回归得到Q 关于t 线性方程，其斜率即为烟碱跨口腔黏膜扩散的稳态渗透速率Jss （µg/cm2/min）。

此外，烟碱的表观渗透系数Papp(cm/s)与其稳态渗透速率（Jss）及供给室的烟碱浓度C0通常存在如下关系：

由方程（2）即可求得烟碱的表观渗透系数。

2 结果与讨论

2.1 烟碱龙胆酸盐形貌晶体结构分析

龙胆酸晶体结构（图3）显示，晶体整体呈片层结构，每一层呈波浪形展开，层与层之间上下错落有致，其形貌正好与后续的晶体堆积结果形成相互验证。

2.2 烟碱龙胆酸盐晶体结构分析

X-射线单晶衍射结构分析表明，烟碱龙胆酸盐由1 个加氢的烟碱阳离子（一价）与1 个龙胆酸根离子（一价）组成。该化合物属单斜晶系，单个分子相对分子质量为316.35，P21空间群，密度为1.342 g/cm3。晶胞参数和结果氢键分别见表2 和表3，晶体结构如图4 所示，晶体结构堆积图如图5，原子编号见图6。

图3 烟碱龙胆酸盐晶体光学显微形貌（放大100 倍）Fig. 3 Optical microscopic morphology of nicotinic gentisate crystal (100 times magnification)

图4 烟碱龙胆酸盐单晶晶体结构Fig. 4 Single crystal structure of nicotinic gentisate

表2 晶体数据Tab. 2 Crystal data

表3 烟碱龙胆酸盐中氢键键长键角结果Tab. 3 Results of hydrogen bond length and bond angle in nicotinic gentisate

图5 烟碱龙胆酸盐晶体结构堆积图Fig. 5 Accumulation diagram of nicotinic gentisate crystal structure

图6 烟碱龙胆酸盐晶体结构图Fig. 6 Crystal structure of nicotinic gentisate

化合物通过离子键紧密结合，烟碱吡咯环上的氮（N2）结合一个龙胆酸的羧基氢（H2），整体带一个正电荷，且通过氢键N2-H2···O1 与一个龙胆酸根离子相连，形成1:1 的烟碱龙胆酸盐。

烟碱吡咯环上的氢（H16B）与旁边的烟碱吡啶环上的氮（N1）通过氢键C16-H16B···N1 结合；龙胆酸的羟基氢（H4）与旁边龙胆酸羧基上的双键氧（O2）通过氢键O4-H4·O2 结合。晶体结构以烟碱（蓝色）/龙胆酸（黑色）1:1 结合为最小单元，烟碱分子之间通过氢键依次结合，且吡咯环中心处于同一平面，与烟碱结合的龙胆酸依次上下交替排列，嵌插在2 个烟碱平面之间，且相邻的龙胆酸分子之间以氢键相互结合。

2.3 烟碱龙胆酸盐含量的测定

利用所建HPLC 分析方法，测定烟碱龙胆酸盐中烟碱的含量。色谱结果如图7所示。样品连续测定3次，记录其烟碱峰面积并计算其平均值为4752.5 mAU。图7 显示，烟碱在8.0 min 左右出峰，在约3.0 min 时观察到一微弱的吸收峰，经鉴定为残留的未成盐的游离龙胆酸。根据标准曲线方法，计算出烟碱龙胆酸盐中烟碱的体积平均浓度为0.447 mg/mL，质量平均浓度为0.443 mg/mg。

图7 烟碱龙胆酸盐的HPLC 色谱图Fig. 7 HPLC chromatogram of nicotinic gentisate

2.4 烟碱龙胆酸盐跨膜扩散特性研究

按照1.2.5 实验操作进行取样及测定，扣除空白后测定烟碱含量，绘制不同pH 和初始烟碱单体及烟碱-龙胆酸盐浓度和跨膜扩散接受池中烟碱浓度-时间关系曲线，结果如图8 所示。

图8 不同pH 和浓度下烟碱龙胆酸盐跨膜扩散接受池烟碱浓度-时间曲线Fig. 8 Nicotine concentration-time curves of nicotinic gentisate in transmembrane diffusion acceptor

由图8 可知，在pH5.5 和pH6.7 两种扩散介质中，烟碱龙胆酸盐和烟碱单体接收池内的烟碱浓度均随着时间延长，表现出显著增加的趋势。由于猪口腔粘膜状态存在一定的差异，扩散开始前15 min 内，烟碱透过粘膜屏障过程还没有达到稳态，因而各条件下烟碱及烟碱龙胆酸盐未表现出各自的扩散特性。对比15 min 后各条件下接收池中烟碱浓度可以得出，一定初始浓度以及pH 条件下，烟碱龙胆酸盐的扩散速率明显低于相应初始浓度及pH 条件下烟碱单体的扩散速率，说明烟碱龙胆酸盐具有缓释烟碱的特性。同时，对比烟碱单体在不同pH 下的扩散情况可知，随着介质pH 值的减小，烟碱的跨膜扩散速率减小。这是由于烟碱在溶液中以中性烟碱分子、单质子态烟碱正离子和双质子态烟碱正离子3 种形态存在；而质子态的烟碱与中性烟碱分子透过口腔粘膜的方式存在差异，导致质子态的烟碱透膜速率低于中性烟碱分子[8]。随着溶液pH 的减小，烟碱质子化程度加大，从而透过口腔粘膜的速率减小。对比烟碱龙胆酸盐在不同pH条件下的透膜扩散浓度曲线可知，相较于pH6.7 的介质环境，烟碱龙胆酸盐在pH5.5 的介质中表现出更为缓慢的释放特性，说明介质pH 越低，烟碱龙胆酸盐对烟碱的缓释效果更突出。分析不同初始浓度下的扩散情况可知，烟碱龙胆酸盐在不同初始浓度下，对烟碱的缓释效果也表现出一定程度的差异。综合上述猪口腔跨膜扩散结果，烟碱龙胆酸盐具有显著的缓释烟碱扩散的效果，且缓释效果与介质pH 和烟碱盐的初始浓度有关。

同上，各取样点对应的烟碱平均累积渗透量结果见表4。根据表4 数据，线性回归得到不同pH 下的Q-t 线性关系及烟碱龙胆酸盐跨膜扩散的稳态渗透速率（Jss），并由方程（2）可计算出烟碱表观渗透系数（Papp），结果见表5。

烟碱累积渗透量与扩散时间的关系图，见图9。结合图9 及表5 的结果可知，在pH5.5 和pH6.7 介质中的表观渗透系数均大于2×10-6，说明烟碱龙胆酸盐在该pH 范围内的渗透性较好，容易跨膜扩散。在相同的初始浓度条件下，烟碱龙胆酸盐在pH5.5 介质中的稳态渗透速率小于pH6.7 介质中的稳态渗透速率，表明，烟碱龙胆酸盐在低pH 介质中具有相对偏慢的渗透速率，即具有更为显著的缓释特性。在相同pH 条件下，表现出初始浓度越高，稳态渗透速率越大，即跨膜扩散越快。总体来看，烟碱单体在两种pH 环境下均表现出良好的跨膜扩散特性，烟碱龙胆酸盐具有明显的缓释扩散特性，且在低pH 介质中缓释效果更为显著。

表4 不同pH 及浓度下的烟碱龙胆酸盐接受池中烟碱平均累积渗透量（n= 12）Tab. 4 The average cumulative nicotine permeability of nicotinic gentisate at different pH and concentration in transmembrane diffusion acceptor（n= 12）

表5 不同pH 及浓度下烟碱龙胆酸盐的烟碱跨膜扩散稳态渗透速率及表观渗透系数Tab. 5 Permeability rate and apparent permeability coefficient of nicotine transmembrane diffusion of nicotinic gentisate at different pH and concentration

2.5 基于烟碱龙胆酸盐的产品开发

目前大多数无烟气烟草制品烟碱引入方式主要是通过直接添加烟碱或烟草粉末，这会带来三方面的主要问题：一是劲头过大引起消化道的不适；二是释放过快不能提供持续长效的生理满足感；三是口感较差，刺激性大。从以上研究可以看出，烟碱龙胆酸盐具有明显的缓释扩散特性，在无烟气烟草制品开发中可以将其作为烟碱的替代形式，丰富产品的配方设计。新烟碱形式的引入，可以减缓烟碱的释放速率，延长生理满足感和口感，可在一定程度上调控烟草制品本身的苦涩感。

3 结论

成功合成了烟碱龙胆酸盐，培养获得单晶体，首次报道了该盐的晶体结构。龙胆酸的羧基部分与烟碱发生反应，生成由1 个加氢烟碱阳离子与1 个龙胆酸根离子组成的烟碱龙胆酸盐。体外模拟口腔环境的跨膜扩散实验表明了烟碱龙胆酸盐具有显著的缓释扩散效果。本研究可为新型烟草制品研发新的烟碱引入形式提供参考和借鉴，为打造新型烟草技术新优势提供支撑。