冠心病病人外周血miR-126与sVCAM-1的表达及其相关性研究

冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)发生主要与脂质代谢紊乱、脂质在冠状动脉内膜沉积形成粥样斑块有关，进而引起动脉血管管腔狭窄、血流流速变慢，甚至堵塞，最终引起心肌缺血、梗死、心力衰竭、猝死等恶性后果。尽管人们对动脉粥样硬化的研究已达百年，其确切的发病机制仍然未完全研究清楚，但是普遍认为炎症反应是动脉粥样硬化的主要致病机制之一[1-3]，白细胞在血管内皮聚集及黏附是炎症的起始步骤，这一过程是由血管内皮细胞表面的细胞黏附分子及炎症细胞所介导，其中血管间黏附分子-1(sVCAM-1)与冠状动脉粥样硬化关系极为密切[4-6]。微小RNA(miRNA)是真核生物的非编码RNAs小分子，miR-126是miRNAs家族中的一员，临床研究显示，miR-126在新生血管的调控及血管内皮损伤修复等方面发挥着非常关键的作用[7-10]。本研究对冠心病病人外周血miR-126与sVCAM-1表达及相关性进行了研究，以探讨其在冠心病发生发展中可能的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2016年6月—2016年12月在我院住院确诊的冠心病病人80例为研究对象(冠心病组)，其中稳定型心绞痛病人和不稳定型心绞痛病人均行冠脉造影检查，冠状动脉主干或其主要分支狭窄程度均≥50%，符合稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、急性心肌梗死的诊断标准。排除标准：既往有心肌病、心肌梗死、心脏瓣膜病病史者；恶性疾病、自身免疫性疾病、急慢性感染性疾病；严重肝肾功能异常者；应用免疫抑制剂及免疫调节剂者；妊娠、哺乳期女性。80例中男47例，女33例；年龄48～82(58.92±10.14)岁；吸烟26例；高血压37例，糖尿病11例，高脂血症68例，急性冠脉综合征(急性心肌梗死23例，不稳定型心绞痛38例)61例，稳定型心绞痛19例；冠状动脉受累支数为单支23例，多支57例。选取同期门诊健康体检无异常的40名中老年人为对照组，男24名，女16名；年龄40～80(61.18±9.75)岁；吸烟12名。两组在性别、年龄、吸烟等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2 方法

1.2.1 试剂及仪器 M-MLV逆转录酶和逆转录茎环引物、Has-miR-126茎环引物购自上海生工生物技术有限公司，Trizol试剂购自Takapa公司，PCR检测仪购自美国罗氏公司，sVCAM-1检测试剂盒购自上海BG公司，M1000 Pro全波长多功能酶标仪购自上海首立实业有限公司。

1.2.2 血清miR-126的检测方法 采集受试者外周静脉血2 mL ，在离心机内以3 000 r/min转速离心处理15 min，分离血清，取250 μL用蛋白酶K溶解后水浴2 h，温度56 ℃，之后按照Trizol试剂说明提取血浆总RNA。取总RNA样品2 μL加入水、缓冲液、RNA酶抑制剂、dNTP Mix及逆转录茎环引物共计10 μL，离心后在PCR仪中反应，反应条件为：37 ℃，反应时间：60 min，所得产物置-4 ℃冷藏箱内保存，GAPDH为内参照物，以荧光定量检测定量盒测定Hsa-miR-126茎环引物序列，分别为：上游5′-GGGGTCGTACCGTT-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′，反应预变性设定反应条件为94 ℃，反应时间为2 min，继以94 ℃20 s，60 ℃34 s，共进行45个循环，将所得数据进行统计分析。以real-tim e qPCR检测miR-126的表达量，采用2-△Ct评估，△Ct=miR-126 Ct值-GAPDH Ct值。

1.2.3 血清sVCAM-1检测方法 采集受试者外周静脉血2 mL，在离心机内以3 000 r/min转速离心处理15 min，分离血清，采用夹心酶联免疫吸附法测定sVCAM-1。

1.2.4 血清炎性因子检测方法 采集受试者外周静脉血3 mL，离心处理后取上清液测定，超敏C反应蛋白(hs-CRP)以免疫透射比浊法测定，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)均以双抗夹心法测定。所有试剂均购于美国MARKETINC公司。

1.3 统计学处理 应用SPSS 19.0统计学软件进行分析。计量资料采用t检验，相关性分析采用Pearson相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血清miR-126、sVCAM-1及相关炎性因子表达水平比较 冠心病组miR-126表达量低于对照组，sVCAM-1及相关炎性因子表达水平高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 两组血清miR-126、sVCAM-1及相关炎性因子表达水平比较(±s)

2.2 冠心病病人血清miR-126、sVCAM-1及相关炎性因子表达水平比较 急性心肌梗死组miR-126表达低于不稳定型心绞痛组和稳定型心绞痛组(P<0.05)，不稳定型心绞痛组低于稳定型心绞痛组(P<0.05)，急性心肌梗死病人sVCAM-1及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、hs-CRP表达均高于不稳定型心绞痛和稳定型心绞痛组(P<0.05)，不稳定型心绞痛组sVCAM-1及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、hs-CRP表达均高于稳定型心绞痛组(P<0.05)。详见表2。

表2 冠心病病人组间血清miR-126、sVCAM-1及相关炎性因子表达水平比较(±s)

与急性心肌梗死组比较，①P<0.05；与不稳定型心绞痛组比较，②P<0.05。

2.3 冠心病病人血清miR-126水平与sVCAM-1及相关炎性因子的相关性分析 Pearson相关分析显示，冠心病病人血清miR-126与sVCAM-1 及炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、hs-CRP表达均呈负相关(P<0.05)。详见表3。

表3 冠心病病人miR-126水平与各变量Pearson相关性分析

3 讨 论

冠心病的主要病因是冠状动脉粥样硬化，冠状动脉粥样硬化的形成及发展过程如下：脂质条纹形成-纤维样斑块形成-粥样斑块形成-并发症病灶形成，而且冠状动脉不稳定型粥样硬化斑块的破裂是引起急性冠脉综合征的直接原因[11-14]，在此过程中斑块内炎性细胞及其炎症产物的形成及释放是导致斑块破裂的关键因素，临床大量研究证实，炎性细胞与内皮细胞黏附分子与动脉粥样硬化斑块的炎症反应关系密切，其中细胞黏附分子(CAMs)是引起炎症反应的关键[15-16]。CAMs是一类介导细胞与细胞外基质、细胞之间互相作用的表面糖蛋白，VCAM-1是属于黏附分子中免疫球蛋白家族成员，主要黏附在血管内皮细胞表面，促进白细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞等在血管内皮细胞上黏附，引起血管内皮损伤，同时促使单核细胞移行至内皮下层转化为泡沫细胞，为淋巴细胞提供抗原诱发免疫调节反应，释放炎症因子促进动脉粥样硬化斑块的形成及破裂，如VCAM-1表达上调，引起内皮细胞与白细胞、单核细胞等炎症细胞之间的黏附更为牢固，穿透内皮细胞间隙，向深部浸润，同时还会释放出其他炎症介质引起炎症级联反应，引起血管内皮的损伤。sVCAM-1是VCAM-1在血管内皮细胞脱落后进入血液中的表达形式，与血栓形成、炎症反应、免疫调节、损伤修复等均有关，发挥重要作用，在正常情况下血清sVCAM-1表达水平相对稳定，在有炎症反应时sVCAM-1会明显升高，使得炎症反应进一步加重，引起对血管内皮及组织的损伤，临床研究显示，冠心病病人血清sVCAM-1明显升高，而且与冠状动脉斑块的稳定性也关系密切，不稳定斑块病人sVCAM-1会明显高于稳定性斑块病人[17-19]。本研究对冠心病病人血清sVCAM-1及相关炎性因子的表达进行了研究，结果显示病人血清sVCAM-1及相关炎性因子表达较正常人群明显上调，而且在急性心肌梗死病人中表达上调变化更为明显，说明检测sVCAM-1及相关炎性因子不仅可作为冠心病的辅助诊断指标，还可用于病情活动度及严重程度的监测，而且与冠心病的发生发展均关系密切。

miR-126是一种微小RNA，编码基因位于血管内皮细胞的特异性表达基因的第7个内含子，对多种组织的特异性较高，如消化系统、呼吸系统、造血系统、生殖系统等均有特异性表达，但是尤以心血管系统特异度表达最高，与细胞的增殖及免疫调节有关。临床大量研究结果显示，血清miR-126与高血压、冠心病、冠状动脉粥样硬化、心力衰竭等心血管疾病均有关，冠心病主要表现为冠状动脉血管的狭窄及堵塞[7-9]，同时有异常的血流动力学改变，而应激与炎症等因素可加重其病程，其中炎症与冠心病关系最为密切，VCAM-1是冠状动脉粥样硬化斑块炎症反应过程中的关键环节，而临床研究已经证实VCAM-1是miR-126的靶点，miR-126的表达升高同时存在VCAM-1表达下调，miR-126的表达下调同时存在VCAM-1表达上调，相应炎性因子表达水平上调，增强白细胞与内皮细胞的黏附。血管内皮细胞在凋亡过程中可产生凋亡小体，使miR-126介导的趋化因子配体12的表达升高，同时还能减弱G蛋白信号16调节器的靶向作用，从以上途径影响到冠状动脉粥样硬化斑块的稳定性。有研究显示，在冠心病病人血清中miR-126的水平与血脂水平呈现密切相关性，是缺血相关血管生成信号的主要调节位点及靶点，是急性心肌梗死的标记物，在心肌梗死后重构中发挥了重要作用[20-23]。有研究发现急性心肌梗死病人检测到的miRNA中明显表现为异常，推测其可能对miR-126抑制转录因子PIK3R2和SPRED1表达，进而影响到成纤维生长因子和血管内皮生长因子的表达上调，促进新生血管的生成[10]。以上研究均表明miR-126的异常表达可影响到冠心病的发生及病情进展。本研究对冠心病病人血清miR-126表达进行了研究，结果显示冠心病病人存在miR-126表达下调，而且急性心肌梗死病人较稳定型及不稳定型心绞痛病人miR-126下调更明显，miR-126的表达与冠心病病情进展有关，可影响到冠心病病情的发展。本研究对冠心病病人血清miR-126与sVCAM-1及相关炎性因子表达进行了相关性研究，结果显示血清miR-126与sVCAM-1及相关炎性因子均呈负相关性，这也进一步提示冠心病病人血清sVCAM-1表达上调可能是miR-126在转录后对VCAM-1的调节失调所致，但是其具体调节机制尚需进一步深入研究。

综上所述，冠心病病人存在明显的miR-126表达下调及sVCAM-1及相关炎性因子表达上调，与病情活动及冠状动脉受累严重程度密切相关，下调的miR-126失去对sVCAM-1及相关炎性因子的抑制可能是导致冠心病发生及发展的主要机制之一，在临床上可通过检查血清miR-126及sVCAM-1的表达进行冠心病的病情评估。