miR-328、miR-147和miR-22在慢性心力衰竭病人中的表达变化及临床意义

费松柏1，陈小霞1，马可忠，刘 娟

心力衰竭是由心肌损伤所致的心脏结构与功能改变的临床综合征，是大部分心血管疾病发展的终末期，一旦出现心力衰竭症状，病人的生存期和多数恶性肿瘤病人相似[1-2]。若能够早期识别诊断“前临床心衰阶段”并及时干预，或许能改善慢性心力衰竭病人的预后[3]。微小RNA(miRNA)是一种真核细胞胞质中不编码蛋白的小RNA分子，含有18～25个碱基。miRNA发挥作用的机制是以种子系列中的2-7nt序列来配对靶mRNA 3′端非翻译区的片段，进而识别靶mRNA而发挥作用[4]。相关文献报道，miRNA在心血管疾病中表达水平异常，参与了心血管疾病的发生发展[5-6]。慢性心力衰竭作为大多数心血管疾病的最终归宿，miRNA可能在慢性心力衰竭中表达异常，对该病的早期诊断、治疗及预后判断中有重要价值。冯荣等[7]研究发现，miR-328、miR-22及 miR-147在冠心病病人中存在异常表达，可能成为冠心病疾病诊断及治疗的新靶点。但上述3个miRNA是否参与了慢性心力衰竭的发病尚未见研究报道。基于此，本研究拟选慢性心力衰竭病人与健康查体者进行对照研究，分析两组miR-328、miR-147和miR-22表达差异及其临床意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取郧西县人民医院2017年6月—2018年6月收治的62例慢性心力衰竭病人设为研究组，纳入标准：①依据中华医学会心血管病分会2007年制定的《慢性心力衰竭诊断治疗指南》中的诊断标准确诊为慢性心力衰竭；②美国纽约心脏病协会 (NYHA)心功能分级在Ⅱ～Ⅳ级；③心脏彩超检查显示，左室射血分数(LVEF)<50%；④病程超过1年，且经治疗后病情已稳定；⑤2周内未服用任何抗血小板、抗血栓等药物；⑥纳入对象之间均无亲属血缘关系；⑦签署知情同意书。排除标准：①合并多脏器功能衰竭者；②合并血液系统疾病者；③合并恶性肿瘤者；④合并糖尿病、全身急慢性感染者；⑤合并肝功能异常者；⑥合并出血性疾病者。另选同期62名健康查体者设为对照组。研究组年龄52～79岁，对照组年龄50～78岁。两组一般资料比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。详见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及质量鉴定 外周血血浆样本：抽取外周静脉血5mL，以3000r/min分离出血浆，再以12 000 r/min分离血浆中的细胞碎片，继续以25 000 r/min分离血浆中细胞碎片上的核酸，将离心处理后的血浆冻存于-80 ℃冰箱待提取。使用德国Qiagen 公司生产的miRNeasy试剂盒按照说明书提取RNA，使用荧光定量RNA反转录结合cDNA聚合酶链式扩增技术(RT-PCR)扩增SNORD44引物鉴定质量，提取的RNA置于-80 ℃冰箱中冻存待测。外周血单个核细胞样本：将按1∶1将外周静脉血与PBS溶液混合，铺在淋巴细胞分离液上，1 500 r/min离心处理，离心管出现4层液层后，收集第2层液层用PBS重悬，继续以1 000 r/min速率离心处理2次，收集细胞提取RNA。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR反应 使用96孔反应板，每个样本重复3次反应，取均值。使用美国GeneCopoeia公司生产的All-in-One miRNA qRT-PCR检测试剂盒进行，扩增用罗氏LightCycler 480 Ⅱ扩增仪，95 ℃变性10 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸10 s 40次，72 ℃延伸5 min，参照RNU6-2计算扩增的△Ct，确定miRNA表达水平。

1.3 观察指标 ①对比分析两组外周血、单核细胞的miR-328、miR-147和miR-22表达水平。②比较研究组病人不同心功能分级的外周血、单个核细胞的miR-328、miR-147和miR-22表达水平。③比较冠心病、风湿性心脏病、扩张型心肌病所致的慢性心力衰竭病人血浆miR-328、miR-147和miR-22表达水平。

1.4 统计学处理 采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析。计量资料采用方差分析、t检验；计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 两组血浆miRNA表达水平比较 研究组血浆miR-328、miR-22表达水平高于对照组，miR-147表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表2。

组别例数miR-328miR-22miR-147研究组621.47±0.180.96±0.150.43±0.14对照组620.46±0.070.49±0.101.04±0.19t值41.17820.528-20.352P0.0000.000 0.000

2.2 两组单核细胞中miRNA表达水平比较 研究组单核细胞miR-328、miR-22表达水平高于对照组，miR-147表达水平低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表3。

组别例数miR-328miR-22miR-147研究组622.87±0.271.66±0.141.34±0.28对照组622.61±0.181.35±0.094.45±0.31t值6.30914.666-58.621P0.0000.000 0.000

2.3 不同程度慢性心力衰竭病人外周血miRNA表达水平比较 随着慢性心力衰竭心功能分级升高，病人血浆miR-328、miR-22表达水平显著升高，miR-147表达水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表4。

心功能分级例数miR-328miR-22miR-147Ⅱ级191.37±0.150.87±0.140.55±0.19Ⅲ级201.52±0.17①0.99±0.17①0.37±0.16①Ⅳ级231.68±0.19①②1.03±0.19①②0.30±0.13①②P<0.05<0.05<0.05

与Ⅱ级比较，①P<0.05；与Ⅲ级比较，②P<0.05。

2.4 不同程度慢性心力衰竭单核细胞miR-328、miR-147和miR-22表达水平比较 随着慢性心力衰竭心功能分级升高，单核细胞miR-328、miR-22表达水平显著升高，miR-147表达水平显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。详见表5。

心功能分级例数miR-328miR-22miR-147Ⅱ级192.76±0.371.56±0.111.48±0.26Ⅲ级202.89±0.41①1.69±0.13①1.34±0.22①Ⅳ级233.12±0.45①②1.82±0.16①②1.29±0.17①②P<0.05<0.05<0.05

与Ⅱ级比较，①P<0.05；与Ⅲ级比较，②P<0.05。

2.5 不同病因所致慢性心力衰竭血浆miRNA表达水平比较 不同病因所致的慢性心力衰竭病人血浆miR-328、miR-147、miR-22表达水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。详见表6。

病因例数miR-328miR-22miR-147冠心病 271.44±0.150.95±0.130.44±0.10风湿性心脏病171.49±0.170.97±0.150.40±0.12扩张型心肌病181.48±0.140.98±0.160.47±0.11P>0.05>0.05>0.05

2.6 miR-328、miR-147、miR-22表达水平与脑钠肽(BNP)、左室舒张末期内径(LVEDD)及LVEF的相关性 miR-328、miR-147表达水平与BNP、LVEDD呈正相关，与LVEF呈负相关(P<0.05)；miR-22表达水平与BNP、LVEDD呈负相关，与LVEF呈正相关(P<0.05)。详见表7。

表7 miR-328、miR-147、miR-22表达水平与BNP、LVEDD及LVEF的相关性

2.7 慢性心力衰竭危险因素分析 miR-328、miR-147、miR-22是慢性心力衰竭的独立危险因素，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表8。

表8 慢性心力衰竭危险因素回归分析

3 讨 论

随着人口老龄化及医学技术发展，心肌梗死救治水平升高，慢性心力衰竭患病率呈不断升高趋势，成为严重威胁中老年人群健康的心血管疾病。慢性心力衰竭病人心室充盈、射血功能异常，临床表现为乏力、液体潴留、呼吸困难等[8-9]。慢性心力衰竭可分为4个阶段，包括前心力衰竭、前临床心力衰竭、临床心力衰竭、难治性终末期心力衰竭[10-11]。临床上主要以血浆利钠肽作为辅助诊断心力衰竭的指标，但诊断效果并不理想[12]。

miRNA是一种高度保守的非编码小分子RNA，代谢周期长，稳定性好，适合作疾病标志物。miRNA主要通过与配对的特殊位点结合，起到降解靶基因mRNA或间接抑制靶基因转录后的翻译的作用，进而调控基因的表达水平；另外miRNA还具有刺激某些靶基因表达的作用[13-14]。miRNA具有多重生物学功能，其参与了细胞的分化、增殖、凋亡等一系列过程，与机体激素分泌、心血管疾病、糖尿病、肿瘤发生等关系密切[15-17]。人miR-328具有双重调节作用，相关研究表明，急性心肌梗死病人miR-328表达水平升高[18]。本研究显示，慢性心力衰竭病人外周血及单核细胞中的miR-328表达相对健康人群显著升高，且随着心力衰竭程度加重而增高，其可能原因为慢性心力衰竭病人机体处于应激状态下，增加miR-328的释放，使血浆及单核细胞中检测到的miR-328明显升高。人miR-147是一种与炎症相关的miRNA。相关研究表明，冠心病病人miR-147呈低表达[19]。本研究中慢性心力衰竭病人血浆及单核细胞中的miR-147表达水平相对健康人群下降，随着慢性心力衰竭程度加重下降更明显，提示miR-147可能通过受损的心肌组织及单核细胞释放。miR-22是一种抗凋亡的miRNA，相关研究显示miR-22在急性心肌梗死病人中表达水平升高[18]。本研究显示，慢性心力衰竭病人血浆及单核细胞中的miR-22表达水平均升高，miR-22在血浆及单核细胞中一致的变化特点提示其可能通过单核细胞释放。miR-147、miR-22、miR-328在慢性心力衰竭病人与健康查体者之间的差异化表达，有望作为临床鉴别诊断慢性心力衰竭的标志物。同时，miR-328、miR-147表达水平与BNP、LVEDD呈正相关，与LVEF呈负相关；miR-22表达水平与BNP、LVEDD呈负相关，与LVEF呈正相关；miR-328、miR-147、miR-22是慢性心力衰竭的独立危险因素。提示miR-328、miR-147、miR-22的水平变化反应了慢性心力衰竭病人心室重构程度，可作为预测慢性心力衰竭的重要指标。

综上所述，miRNA具有高稳定性的特点，miR-22、miR-328、miR-147的表达水平在慢性心力衰竭病人中表现为升高或下降趋势，与健康人群差异显著，miR-328、miR-147、miR-22表达水平与慢性心力衰竭病人BNP、LVEDD、LVEF存在相关性，是慢性心力衰竭的独立危险因素，有望作为慢性心力衰竭诊断及判断病情的标志物。但miRNA检测费用高昂、循环次数多且浓度低，容易出现较大误差，加上miRNA容易降解，容易造成检测结果与实际不符[20-21]。另外miRNA在疾病中的作用尚不完全清楚，诸多问题仍需进一步研究解决。