松果菊苷对帕金森病模型大鼠纹状体GRP78及MANF表达的影响

陈乃洁，钟佳男2，唐岚芳2，刘 婷2，杨莎莎2，许 茜，林 瑶，肖绍坚3，林友宁3，蔡 晶

帕金森病(Parkinson′s disease，PD)是一种神经系统变性疾病，其主要的病理改变为黑质-纹状体多巴胺能神经元的丢失及路易体的形成[1]。目前研究发现，帕金森病的发病机制与过度的内质网应激相关，葡萄糖调节蛋白78(78 kDa glucose-regulated protein，GRP78)为重要的内质网伴侣蛋白，内质网应激可诱导其表达增加[2]。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)为一种新型神经营养因子，可有效地保护并修复中脑多巴胺神经元[3]，目前认为MANF的功能与内质网应激关系密切[4]。 已有研究发现，以肉苁蓉为主要组成成分的中药复方对PD有一定治疗作用[5]，而松果菊苷(echinacoside，ECH)是肉苁蓉最主要的有效成分之一[6]。故本研究旨在探讨松果菊苷对鱼藤酮诱导的PD大鼠模型纹状体中GRP78及MANF表达的影响，以明确中药复方苁蓉精治疗PD的可能机制。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器 鱼藤酮、葵花油(美国Sigma公司)；松果菊苷粉末(中国南京景竹公司)；GRP78、MANF抗体(英国abcam公司)，β-actin抗体(武汉三鹰公司)，HRP标记山羊抗兔二抗(武汉爱博泰克公司)；Gel DOC 2000型凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)；电泳槽及转膜仪(美国Bio-Rad公司)；DU-650型蛋白分析仪(美国Beckma公司)；5417R 高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。

1.2 实验动物与分组 无特定病原体动物(SPF)级成年健康雄性SD大鼠32只，动物合格证号：SCXK(沪)2018-0004，体质量215～245 g，由福建中医药大学实验动物中心提供及饲养。饲养室温20～25 ℃，照明时间08：00～20：00，自由摄食与饮水。大鼠经适应性饲养1周后，根据SPSS软件随机分为正常组、溶剂组及造模组，将造模成功的PD大鼠随机分为模型组和治疗组，每组8只。

1.3 造模与给药 鱼藤酮加入葵花油配置成浓度为1.5 mg/mL的鱼藤酮葵花油乳化液，造模组大鼠予以颈背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液1.5 mg/(kg·d)，连续注射2周，1周后休息1 d[7]。溶剂组注射等体积葵花油。造模成功后，治疗组采用浓度为2 mg/mL的松果菊苷纯水溶液灌胃，治疗浓度为20 mg/kg，每日1次，治疗2周。其余各组予以等量生理盐水灌胃。

1.4 行为学检测 选一直径约3 mm的铁丝线，水平固定于距地面30 cm处。将大鼠悬挂于铁丝线上，以其前爪攀附，后肢或尾巴挂于线上则重新开始，不可翻坐于线上，记录其悬挂时间[8]。各组大鼠在松果菊苷治疗前1 d及治疗14 d后进行检测，每只测量3次，每次间隔约10 min，取均值分析。

1.5 取材 实验大鼠于药物干预14 d后取材。大鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉，迅速断头取脑，于冰盘上取出纹状体，0.9%氯化钠冰溶液冲洗除去血液，滤纸吸干，置-80 ℃冰箱保存备用。

1.6 蛋白质印迹法(Western Blot)检测GRP78和MANF表达 取适量大鼠纹状体组织，加RIPA裂解液备制匀浆组织，离心取上清。匀浆上清用蛋白质定量(BCA)法进行蛋白定量。配胶，取出蛋白样品，水浴锅中煮沸5 min，将样品加入SDS-PAGE胶加样孔中，电泳。取出已电泳完的SDS-PAGE胶放于转膜液中，切取所需目的胶体，进行转膜。转膜完成后，PVDF膜用TBS摇床缓慢漂洗5 min，再放入5%脱脂奶粉中，室温下摇床缓慢摇动封闭2 h。封闭完成后的聚偏氟乙烯(PVDF)膜放入GRP78、MANF抗体(1∶1 000)4 ℃摇床孵育过夜；一抗孵育完成用TBST洗膜后，加入HRP标记山羊抗兔二抗(1∶10 000)室温1 h摇床孵育，再次用TBST洗膜。最后加入ECL显色剂(化学发光底物和稳定剂以1∶1混合)反应1 min，放置于成像仪内进行曝光成像，用Image Lab软件半定量分析并记录相应条带的灰度值。

2 结 果

2.1 4组大鼠悬挂试验结果比较 治疗前，模型组与治疗组大鼠悬挂时间明显短于正常组(P<0.05)。治疗14 d后，治疗组大鼠悬挂时间较模型组延长(P<0.05)。详见表1。

表1 4组大鼠悬挂试验结果 比较(±s) 单位：s

与同时间正常组比较，①P<0.01；与同时间模型组比较，②P<0.05。

2.2 4组大鼠纹状体GRP78、MANF蛋白表达比较 与正常组比较，模型组GRP78蛋白表达增高，MANF蛋白表达降低(P<0.01)。与模型组比较，治疗组GRP78蛋白表达有所降低，MANF蛋白表达有所升高(P<0.01)。详见表2、图 1。

组别只数GRP78/β-actinMANF/β-actin正常组80.684 6±0.047 10.612 1±0.012 3溶剂组80.742 8±0.098 70.600 0±0.022 2模型组81.196 4±0.156 2①0.381 5±0.016 9①治疗组80.882 4±0.055 0②0.444 3±0.012 0②

与正常组比较，①P<0.05；与模型组比较，②P<0.05。

图1 4组大鼠纹状体GRP78、MANF蛋白表达

3 讨 论

PD是一种好发于中老年人的神经退行性疾病，在我国65岁以上人群的患病率为1 700/10万人，并随年龄增长而升高。其核心运动症状包括：运动迟缓、肌强直及静止性震颤，可伴有嗅觉减退或消失、抑郁、睡眠障碍等非运动症状。其主要病理改变为黑质致密部多巴胺能神经元变性丢失及α-突触核蛋白异常聚集导致路易小体形成，进而使纹状体区多巴胺递质降低[9]。随着对PD发病机制研究的不断深入，研究发现内质网应激在PD发病中可能起到至关重要的作用。内质网在蛋白质的合成、加工和转运中发挥着重要的作用，当内质网蛋白负荷超过内质网的折叠能力时，就可导致内质网中异常蛋白质的沉积，从而引起内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。ERS可激活未折叠蛋白反应，GRP78作为内质网分子伴侣，其表达可反映内质网应激的程度[10]。早期未折叠蛋白反应可提高细胞的适应性，使内质网重新达到稳态，但持续过度的内质网应激可诱发ERS相关细胞凋亡[11]。

MANF为一种新型神经营养因子，大部分表达于内质网上，少部分以分泌的形式出现[12]。细胞实验研究发现，MANF可选择性地促进大鼠胚胎期黑质多巴胺能神经元存活[13]；在大鼠中，MANF可提高刺激诱发的多巴胺释放[14]，在PD疾病模型中可有效地保护并修复中脑多巴胺神经元[3]。目前认为MANF的功能与内质网应激关系密切，MANF基因分析提示其启动子区域存在内质网应激反应原件(ER stress response element，ERSE)[15]。研究发现，在6-羟基多巴胺(6-OHDA)诱导的神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)中，外源性的MANF可抑制α-突触核蛋白的过表达，减少细胞凋亡[16]。

现代中医将帕金森病归于“颤证”范围，认为其病机为肾精亏损、脑髓不足，故治法以补肾益髓为主[17]。苁蓉精方是本课题组通过前期临床经验总结和基础研究总结出来的复方，具有补肾益髓的功效，用于治疗PD有一定的效果，已申请为国家专利(专利号：2011103028541)。前期临床研究表明在西药美多芭治疗基础上加用苁蓉精方治疗早中期PD，效果优于单用西药治疗的效果，能有效改善病人的运动功能部分评分[18]。实验研究表明，苁蓉精水提物及纳米微粉均可有效地减少α-突触核蛋白的聚集，减轻1-甲基-4-苯基-吡啶离子(MPP+)诱导的PD模型细胞损伤[19]。松果菊苷为苁蓉精君药肉苁蓉的主要成分之一，多项研究表明，松果菊苷可显著抑制多巴胺神经元丢失，维持黑质纹状体多巴胺及其代谢物水平[20]。本研究发现松果菊苷干预后，大鼠的悬挂时间延长，提示松果菊苷可一定程度地改善PD行为障碍；与模型组比较，治疗组GRP78蛋白表达有所降低，MANF蛋白表达升高，表明松果菊苷可能通过调节内质网应激未折叠蛋白反应，降低GRP78表达，并诱导内质网应激相关的MANF的表达，以促进多巴胺神经细胞的存活。

综上所述，松果菊苷可能通过调节内质网应激相关蛋白GRP78表达及增加MANF的表达以改善PD的运动障碍，为探求苁蓉精治疗PD的机制提供了新的思路，后期可对相关通路进行更深入的探索。