人ALOX5AP基因启动子的克隆及生物信息学分析

臧丽玉 徐晟林 耿学峰 姜恩德 吴从平 赵宝昌

山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271016

脑卒中或脑血管意外，俗称“中风”，具有高残率和高死亡率等特点[1]，全球范围内严重危害人类健康和生命安全。它的发病是由于脑部动脉血管阻塞或血栓形成引起灌流区组织供血不足，或血管破裂引起出血性脑损伤等导致的脑血管疾病[2]。为深入探索其发病的分子机制，Helgadottir等[3]于2004年通过病例-对照研究，在冰岛和英国人群中首次定位了脑卒中的易感基因—ALOX5AP(Arachidonate 5-lipoxygenase activating protein)，它编码的蛋白质(5-脂氧合酶激活蛋白)可将花生四烯酸转化成白三烯。白三烯参与许多促炎过程，加速血栓的形成及动脉粥样硬化，最终导致心肌梗死或脑卒中。但ALOX5AP基因表达升高的调控机制尚不清楚，本研究通过克隆人ALOX5AP基因启动子并构建荧光素酶报告基因表达载体，用生物信息学预测分析其启动子序列、CpG岛及潜在转录因子结合位点，为阐明ALOX5AP基因转录调控机制奠定前期基础，为临床治疗缺血性脑卒中寻找新的策略。

1 材料与方法

1.1 质粒与试剂

荧光素酶报告基因载体pGL3-basic购于Promega公司，E-coli DH5α由山东第一医科大学(山东省医学科学院)生命科学实验室提供。质粒小提试剂盒购于北京Tiangen公司，胶回收试剂盒购于北京Genstar公司，DNA抽提试剂盒、puf 高保真DNA聚合酶、DNA 1kb Marker、MluⅠ及HindⅢ限制性内切酶、DNA连接酶购于Takara(大连生物工程公司)。引物合成与DNA测序由上海生物工程有限公司完成。

1.2 引物设计与合成

在NCBI的Genebank数据库中检索人类ALOX5AP基因，并在Ensembl网站中查找转录起始点在基因中的准确位置(NCBI与Ensembl的网址见表3)，以转录起始点作为+1，获取上游-2 000 bp至-1 bp的序列。针对此序列，利用软件primer premier 6.0设计引物(表1所示)，用于人ALOX5AP基因启动子区域的PCR扩增。为方便后续载体构建，根据序列特点与pGL3-basic的多克隆位点，在引物的5’端引入合适的酶切位点(表1)。

表1 引物序列及修饰的酶切位点

1.3 人ALOX5AP基因启动子质粒的构建

用外周血基因组DNA提取试剂盒提取志愿者血液中的DNA，以此为模板，利用高保真聚合酶PCR扩增人ALOX5AP基因启动子区域2 000 bp的DNA序列，PCR反应程序如表2所示。纯化回收PCR产物后，与pGL3-basic空载体同时以限制性内切酶MluⅠ和HindⅢ双酶切，酶切产物经琼脂糖凝胶电泳检测，并用试剂盒切胶回收两目的片段。定量后，将两片段以摩尔比1∶10的比例混合均匀，加入1 μL T4 DNA连接酶，16℃过夜连接以制备重组质粒。快速热激法在固体 LB培养基(氨苄青霉素 50 μg/mL)的培养皿中转化重组质粒。第2天在培养皿上挑取单克隆，振荡培养16～20 h，质粒提取试剂盒提取质粒DNA，命名为pGL3-A2000。

表2 PCR反应程序

1.4 载体的验证

取提取的pGL3-A2000质粒，分别在37℃水浴锅中进行MluⅠ单酶切和MluⅠ+HindⅢ双酶切，酶切2 h后将产物行琼脂糖凝胶电泳。酶切验证后，选择电泳条带与预期结果一致的为阳性克隆，取阳性克隆菌液寄送上海生工测序平台测序。

1.5 ALOX5AP基因启动子序列的预测分析

登录Promoter 2.0[4]与NNPP (Neural Network Promoter Prediction)网站(网址见表3)，上传ALOX5AP上游2 000 bp的启动序列，利用软件对人ALOX5AP进行潜在的启动子预测和分析。Promoter 2. 0的参数设置取默认值；NNPP的参数设置为启动子最小分值0.8。

1.6 ALOX5AP基因启动子CpG岛分析

分别登陆CpGPlot[5]和Meth Primer[6]两个在线软件的网站(网址见表3)，在搜索框中输入目的DNA序列。2个软件对CpG岛的认定条件如下：①最低长度为200 bp；②最低GC含量为50%；③实际GC含量与期望GC比例最小值为0.6。

1.7 ALOX5AP基因启动子区转录因子结合位点分析

登录AliBaba 2.1程序的网站(网址见表3)，通过在TRANSFAC 4.0站点构建矩阵，获取转录因子与ALOX5AP基因潜在的结合位点。

表3 生物信息学所用网址

2 结 果

2.1 ALOX5AP基因定位分析

Genbank数据库对ALOX5AP基因结构进行分析，结果显示其在染色体NC_000013.11(30713478..30764428)区域内，基因ID为241，基因序列全长为50 950 bp，含有5个外显子。其mRNA登录号为NM_001204406.1，它编码含有161个氨基酸的蛋白质。在Ensembl网站中查找转录起始点位置，以FASTA的格式获得并下载转录起始点上游2 000 bp的序列。本段序列中包括包含潜在的启动子序列，可用于后续分析。

2.2 重组质粒pGL3-A2000的酶切验证

利用高保真Pfu酶，以人外周血DNA作为模板，PCR扩增启动子区域，将扩增片段克隆至pGL3-basic质粒中，将得到的重组质粒pGL3-A2000进行酶切验证(图1)。重组质粒经MluⅠ单酶切后得到6 800 kb的条带，重组质粒经MluⅠ+HindⅢ双酶切后，得到4 800 bp与2 000 bp的2个条带，片段大小与预期一致，表明成功构建了重组质粒。

2.3 重组质粒pGL3-A2000的测序验证

将MluⅠ+HindⅢ双酶切验证正确后的阳性菌液寄送上海生工有限公司，测序结果如图2所示(用chromas软件打开)。在BLAST中进行比对分析，结果显示载体插入序列与基因组序列完全一致，进一步表明重组质粒构建成功。

2.4 人ALOX5AP基因启动子分析

目前，生物学领域分析并预测启动子候选区较常用的软件主要有Promoter 2.0与NNPP(Neural Network Promoter Prediction)等[7]。Promoter 2.0结果表明，ALOX5AP基因-500处有高度可能的启动子区，分值为1.117。NNPP软件显示，在-996 bp至-946 bp 的区域内启动子分值存为1的启动子区，其中在-954 bp 至-904 bp 的区域内启动子分值存为0.98的启动子区(表4)。为更好的进行分析，我们将这3个序列均视为候选区域，进行下一步的探索。

2.5 ALOX5AP基因上游启动区CpG岛检测

预测基因是否含有CpG岛及确定CpG岛的数目可更好的了解基因的表达调控，为了解人ALOX5AP基因启动子区域的甲基化状态，本研究应用CpGPlot和Meth Primer 2个在线软件对CpG岛进行预测，结果显示均未在ALOX5AP上游启动区域发现CpG岛(图3与图4)。

2.6 ALOX5AP基因启动子区转录因子结合位点分析

我们利用AliBaba 2.1程序在TRANSFAC 4.0站点构建矩阵，在ALOX5AP基因启动子区共获得245个潜在的转录因子结合位点，说明人ALOX5AP基因的转录因子比较丰富，表达调控机制比较复杂。为使目标更加精确，我们着重记录了前述3个候选区域的转录因子结合位点，结果见表4。

泳道1：载体经MluⅠ单酶切后电泳；泳道2：DNA 1kb Marker；

泳道3：经MluⅠ+HindⅢ双酶切后电泳。

图1 pGL3-A2000的酶切验证

表4 NNPP对ALOX5AP基因启动子区域的预测结果

图2 pGL3-A2000的测序验证

表4 3个启动子候选区域内的潜在转录因子结合位点

3 讨 论

启动子是基因表达必不可缺的调控序列，没有启动子，RNA聚合酶就无法结合并开始转录，因此鉴定基因的启动子是后基因组时代的基本问题之一。生物信息学软件的开发与利用，可以根据DNA的保守序列特征预测基因的启动子，以此为候选区域后续实验提供思路。本研究也利用这2种软件Promoter 2.0与NNPP(neural network promoter prediction)预测了ALOX5AP基因的启动子区域，结果共发现3个启动子候选区。由于2个软件的预测原理和侧重点有差异，所以预测结果也不尽相同。

DNA甲基化是真核生物中一种重要的表观遗传修饰，它只发生在CpG双核苷酸的胞嘧啶上。基因组中几乎所有管家基因和约一半的组织特异性基因启动子区具有比较高比例的GC含量，这些高GC含量的区域组成一些CpG岛并处于低甲基化状态。而高甲基化状态的CpG岛则会阻碍转录因子的结合，使基因无法转录而失去生物学效应[8]，因此CpG岛的甲基化状态与许多疾病密切相关。本实验结果未在ALOX5AP上游启动区域发现CpG岛，说明ALOX5AP基因可能不受甲基化修饰影响。

启动子属于DNA序列的一段，必须与相应的转录因子结合才能激活基因转录，这是基因表达调控最关键的起始事件。转录因子是参与基因表达调控的一类重要蛋白质，它与DNA结合位点的预测是研究基因转录调控的重要环节，准确的预测将有助于我们认识和研究不同转录因子对目的基因的转录调控的时空性，预测到的转录因子都可以作为治疗疾病的潜在的靶标分子。本实验着重阐述3个候选区域这些转录因子结合位点可能明显影响ALOX5AP基因的转录调控，参与脑卒中的发生发展过程。后续实验中，我们需充分参考此结果来构建一系列截短的荧光素酶表达载体，保证这些转录因子结合位点在载体中的完整性。需要注意的是计算机的预测有一定的局限性，人ALOX5AP的转录调控是否受到这些转录因子的影响，尚需实验进一步验证。

脑卒中是一种严重危害人类健康和生命安全的难治性疾病，是遗传因素和环境因素共同作用而导致的复杂疾病。脑卒中发生的关键机制之一是炎症反应，它通过促进动脉粥样硬化继发血管阻塞和破裂而引起脑血管疾病的发生[9]。研究人员已在多项研究中[10-12]发现，ALOX5AP基因与脑卒中有关，其编码的5-脂氧合酶激活蛋白可与花生四烯酸特异性结合，激活5-脂氧合酶后催化花生四烯酸生成白三烯，细胞炎症因子白三烯与受体结合后参与炎症反应及动脉粥样硬化形成，最终将导致血管狭窄、破裂，加快脑血管疾病的发生发展。由此可见，ALOX5AP基因的表达升高是其始动因素，这很可能发生在基因转录调控水平上。转录水平的调控主要通过转录起始部位一些特殊的调控序列如启动子和作用于启动子区的一些转录因子相互作用引起。深入研究ALOX5AP启动子的结构、功能、作用模式等对于回答脑卒中的一些基本理论问题具有重要意义。

本研究为探讨ALOX5AP基因的转录调控机制，首先设计扩增基因 5’端上游DNA序列的引物，以基因组DNA为模板扩增启动子区域，PCR产物与 pGL3-Basic质粒连接构建荧光素酶报告基因表达载体，经酶切和测序验证载体构建成功。生物信息学软件对ALOX5AP基因启动子进行分析表明，转录起始点上游2 000 bp的序列内有3个启动子候选区，运用转录因子数据库初步筛选出Pit-1α、TBP、TBPWT1-κ、Sox-2等转录因子结合位点，提示ALOX5AP基因可能受这些转录因子的调控,为治疗缺血性脑卒中提供了新的潜在靶点。