复方柴归方抗抑郁作用剂量筛选及药效验证

2020-04-01许腾刘欢高耀令狐婷高晓霞周玉枝田俊生秦雪梅

山西大学学报（自然科学版） 2020年1期

许腾,刘欢,高耀,令狐婷,高晓霞,周玉枝,田俊生,秦雪梅*

(1.山西大学中医药现代研究中心,山西太原 030006;2.地产中药功效物质研究与利用山西省重点实验室,山西太原 030006;3.中国辐射防护研究院药物安全评价研究中心,山西太原 030006)

0 引言

抑郁症是以显著且持久的情绪低落为基本临床特征,呈无趣、无欲、无助、无望、无快感的状态,严重者甚至自杀,是目前最常见的精神障碍之一,也是致残的主要原因之一,严重影响患者的生活、工作和学习[1-4]。

目前临床上治疗抑郁症多以选择性5-HT及去甲肾上腺素(NE)再摄取抑制剂(SNPIs)(文拉法辛)为主,克服了第一代抗抑郁剂MAOI(单胺氧化酶抑制剂)和TCAs(三环类)的心脏毒性和抗胆碱能毒性,但是该类药物整体有效率不超过 70%,起效时间需 2～4 周[5],且存在胃肠功能紊乱、认知功能减退、性欲降低等不良反应[6]。而中药复方在抑郁症治疗中具有多成分、多靶点、多效应、毒副作用小、协同作用强和整体调节的独特优势[7],目前已上市的具有抗抑郁作用的中药复方主要有逍遥丸、解郁丸、解郁安神颗粒、乌灵胶囊、安乐胶囊和柴胡舒肝丸等。

本课题组经过前期对逍遥散的最佳抗抑郁组分进行药效学筛选和抗抑郁物质基础的研究,在逍遥散组方的基础上去掉生姜和茯苓得到复方柴归方,并对其提取工艺进行优化[8-12]。本文在前期对FFCGF进行单次给药毒性预实验和最大耐受量实验的基础上筛选其抗抑郁有效剂量、验证FFCGF抗抑郁药效,并确定其最佳剂量,为确定临床剂量提供基础依据。

1 材料

1.1 主要实验仪器

主要仪器:透明圆筒玻璃缸(高30 cm,直径15 cm);小鼠悬尾实验箱;自制大鼠旷场测试箱(长100 cm、宽100 cm、高80 cm)底部平均分为25格[13]等。

1.2 药品与试剂

复方柴归方(柴胡20 g、当归20 g、白芍20 g、麸炒白术20 g、炙甘草10 g、薄荷6.7 g,以上药材均购于山西省华阳药业有限公司)。经本课题组前期提取工艺研究和药效学筛选,最终确定以乙醇提取合并药渣水提醇沉部分的工艺来制备FFCGF[14]。盐酸文拉法辛胶裹(博乐欣,25 mg/粒,成都康弘药业集团股份有限公司,批号140805)。逍遥丸(浓缩)(200丸/瓶,九芝堂股份有限公司,批号201412074);苦味酸酒精溶液、蒸馏水、蔗糖、水合氯醛等。

1.3 实验动物

实验动物:SPF级ICR雄性小鼠,雄性,体重18～22 g;SPF级SD雄性大鼠体重180～220 g,均购于北京维通利华实验动物技术有限公司,动物许可证号:SCXK(京)2014-0001。自然昼夜节律(12 h白天,12 h黑夜),室温20～25℃,湿度40%～60%,自由饮食饮水(自来水、普通饲料),适应1周。

2 方法

2.1 抗抑郁有效剂量筛选实验

2.1.1 实验分组及给药

根据本课题组前期单次给药毒性实验、最大耐受量实验结果来设剂量筛选实验。适应期结束后,根据小鼠体重随机分为:空白对照组、阳性对照组(盐酸文拉法辛胶囊0.05 g/kg)、剂量1组(FFCGF 28 g生药/kg)、剂量2组(FFCGF 14 g生药/kg)、剂量3组(FFCGF 7 g 生药/kg)、剂量4组(FFCGF 3.5 g生药/kg)、剂量5组(FFCGF 1.75 g生药/kg),每组12只小鼠,其中剂量5组相当于逍遥丸的人日服剂量。空白对照组灌胃(ig)给予蒸馏水20 mL/(kg·d),各给药组药物溶于蒸馏水至相应浓度ig给药,连续14 d,末次给药后1 h。

2.1.2 行为绝望模型

2.1.2.1 小鼠悬尾实验(TST)

在末次给药后1 h,在距小鼠尾尖1 cm处使用用医用胶带粘住将其悬挂在小鼠悬尾实验箱内,使每只小鼠均处于安静且互不干扰的空间内,适应2 min,观察后4 min内小鼠的不动时间(四肢停止挣扎)[15]。

“古玩的价值并不在于器物本身，凝聚在器物上的时间和历史才是真正价值所在。”叶总看王祥一脸不信，继续说道。“刚才我看过你手里的玉坠，从样式上看起来，这个是唐宋时期的款式，上面的纹饰看起来也是那个年代做工，要是我没有看走眼，你的这批玉器来头可不小啊。”

2.1.2.2 小鼠强迫游泳实验(FST)

在末次给药1 h 后,每只小鼠单独置于一个装有清洁水的透明圆柱形有机玻璃缸内,适应2 min,观察后4 min内小鼠的不动时间(四肢停止挣扎)。实验过程中水温保持在(25±1)℃,每只小鼠测试完毕后应及时换水,保证每组水质无差异。测试完成后立即用毛巾擦干并将小鼠归笼[15]。

2.2 抗抑郁药效验证实验

2.2.1 行为绝望模型

根据2.1部分有效剂量筛选结果进行抗抑郁药效行为绝望模型验证,设置空白对照组、阳性对照组(盐酸文拉法辛胶囊0.05 g/kg)、FFCGF高剂量(28 g生药/kg)、FFCGF中剂量(14 g生药/kg)、FFCGF低剂量(7 g生药/kg)、逍遥丸组(14 g生药/kg),其中设置逍遥丸组的剂量相当于FFCGF的中剂量,用于对比基于逍遥散裁化而得的复方柴归方与逍遥丸的抗抑郁作用。具体实验动物及操作同2.1.2.1、2.1.2.2.

2.2.2 慢性温和不可预知应激模型(CUMS)

2.2.2.1 实验分组及给药

大鼠适应1周后,根据第0周测定的糖水偏爱率基线、旷场实验基线、体重基线剂量筛选的结果,将其随机分为空白对照组、模型对照组、阳性对照组(盐酸文拉法辛胶囊,0.035 g/kg)、中西联合用药组(FFCGF中剂量+盐酸文拉法辛胶囊,9.7 g/kg+0.035 g/kg)、FFCGF高剂量(19.4 g生药/kg)、FFCGF中剂量(9.7 g生药/kg)、FFCGF低剂量(4.8 g生药/kg)7个组,每组10只,并用苦味酸酒精溶液进行标号。空白对照组群养(5只/笼),其余各组均孤养。造模同时ig给药,空白和模型对照组ig给予蒸馏水10 mL/(kg·d),各给药组ig给予相应剂量的药物,给药1 h后给予刺激,持续28 d。

参照Willner等[16]方法并进行改进,刺激因子包括束缚,禁食,热应激,禁水,超声刺激,冰水浴,昼夜颠倒,夹尾,足底电击等9种。每日1种,且每种刺激随机3～4次,保证每种刺激不连续出现持续 28 d。在实验第0,7,14,21,28 d分别测定各组大鼠的体重、糖水偏爱率(糖水偏爱率=糖水消耗量/(糖水消耗量+纯水消耗量)),以及旷场试验中的穿越格数和直立次数。

2.3 统计分析

3 实验结果

3.1 有效剂量筛选结果

小鼠FST、TST剂量筛选实验结果(图1)表明,与空白对照组对比,阳性对照药文拉法辛组小鼠不动时间极显著降低(P<0.01);FFCGF剂量1组和剂量2组不动时间具有极显著差异(P<0.01),剂量3组具有显著差异(P<0.05),剂量4组～剂量5组没有显著性差异(P>0.05)。说明FFCGF剂量在组3(7 g生药/kg)～组1(28 g生药/kg)时,可以显著降低小鼠FST、TST不动时间,缓解小鼠“绝望”状态。

3.2 抗抑郁药效验证试验结果

3.2.1 行为绝望模型结果

小鼠TST、FST药效验证实验结果(图2)表明,与空白对照组对比,各给药组小鼠不动时间均显著降低,其中阳性药文拉法辛、逍遥丸、FFCGF高剂量、中剂量组组有极显著差异(P<0.01)。这说明FFCGF剂量在7 g生药/kg～28 g生药/kg时能够缓解小鼠的“绝望”状态,其中14 g生药/kg和28 g生药/kg效果更好。

3.2.2 慢性温和不可预知应激模型实验结果

3.2.2.1 外观及体重

在实验前期的适应阶段,大鼠体态外观和行为活动均表现正常,在实验过程中空白组大鼠也一直维持正常状态。在实验初期,各给药组和模型组大鼠表现出明显的易激惹、敏感等症状；在实验后期,模型组大鼠出现明显的行为活动减少、毛色枯槁、粪便粒数小且数量多等症状。

由图3可知,各组在实验期间体重均呈明显上升趋势。其中,与空白对照组相比,模型组在第7天开始体重出现极显著性差异(P<0.01);与模型组相比,FFCGF各组在第7天开始体重出现极显著差异(P<0.01),阳性药文拉法辛在第21天大鼠体重出现显著性差异(P<0.05),在第21天之后,各给药组大鼠体重均高于模型组且具有显著性差异(P<0.05,P<0.01),说明文拉法辛和FFCGF能够改善由于CUMS模型引起的体重增长缓慢的状态。FFCGF各组从第7天开始就能够显著调节CUMS引起的体重增长缓慢的状态可以推测,FFCGF对缓解应激状态下的食欲不振、消化系统功能减弱引起的体重增长缓慢状态起效较快。由此可见,FFCGF在改善由于应激引起的食欲不振、消化功能减弱而导致的体重增长缓慢的状态速度较快,效果较好。

图1 FFCGF在TST、FST下剂量筛选与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01Fig.1 FFCGF dose screening under TST, FST vs the control group

图2 FFCGF对TST、FST的影响与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01.Fig.2 Effect of FFCGF on TST and FST vs. the control group

图3 FFCGF对CUMS模型体重的影响与空白组比较:#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01.Fig.3 Effect of FFCGF on body weight of CUMS model##P<0.01 vs the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

3.2.2.2 糖水消耗实验

由图4可知,与空白对照组相比,从第14天开始,模型组糖水偏爱率显著降低(P<0.05);与模型组相比,在造模第21天开始,所有给药组的糖水偏爱率均显著回调(P<0.01)。这说明CUMS应激模型能显著降低大鼠糖水偏爱率,模拟快感缺失的症状,文拉法辛和FFCGF各剂量组均能回调糖水偏爱率,较好的改善这一症状。

图4 FFCGF对CUMS模型糖水偏爱率实验的影响与空白组比较:#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01Fig.4 Effect of FFCGF on CUMS model sucrose preference rate experiment #P<0.05,##P<0.01 vs. the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

3.2.2.3 旷场实验

由图5可知,与空白对照组相比,模型组在第14天开始大鼠的穿越格数和直立次数显著降低(P<0.0.1);与模型组相比,在第21天时,文拉法辛组、联合用药组和FFCGF高剂量、中剂量组在回调大鼠旷场中穿越格数和直立次数指标中均出现极显著差异(P<0.01),而FFCGF低剂量组在大鼠穿越格数出现显著差异(P<0.05),在直立次数中并未出现显著差异(P>0.05)。但低剂量组可延缓大鼠在旷场中穿越格数、直立次数降低的趋势。在CUMS应激下,大鼠在旷场实验中出现穿越格数、直立次数减少,说明CUMS模型能降低大鼠自主活动能力。在给药组中,文拉法辛组、联合用药组、FFCGF高剂量、中剂量组均能回调穿越格数、直立次数,说明FFCGF高剂量、中剂量组均能显著缓解大鼠由于CUMS 应激引起的活动能力下降的状态。

图5 FFCGF对CUMS模型旷场实验的影响与空白组比较:#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较:*P<0.05,**P<0.01.Fig.5 Effect of FFCGF on the CUMS model#P<0.05,##P<0.01vs the control group;*P<0.05,**P<0.01 vs. the model group.

4 讨论

逍遥散出自《太平惠民和剂局方》,具有疏肝解郁、调和脾胃之功效,主治肝郁血虚脾弱之症[17]。本研究所用复方柴归方是在逍遥散的基础上进行拆方而来,本课题组前期通过对逍遥散抗抑郁活性部位进行研究发现其低极性部位抗抑郁作用显著,通过成分归属并结合原汤剂在临床上的加减方式用法,裁去生姜、茯苓而得复方柴归方,采用前期筛选的复方柴归方最佳提取工艺给药,筛选抗抑郁有效剂量,验证其抗抑郁药效,并确定最佳抗抑郁剂量[18-21]。

本研究采用行为绝望模型和CUMS模型来进行抗抑郁剂量筛选和初步药效学验证。其中行为绝望模型包括TST、FST动物模型,利用动物不能逃出恶劣环境以致行为绝望的模型[22],是经典的抗抑郁剂量筛选、药效评价模型。CUMS抑郁模型主要模拟了快感缺乏这种人类抑郁的核心症状,同时模拟了轻、中度抑郁症的临床症状[23],是目前公认的经典抑郁模型之一,常用于抗抑郁药物筛选、抗抑郁药物药效评价、抗抑郁药物作用机制及抑郁症病理生理机制的研究。

剂量筛选实验结果显示FFCGF剂量在7 g生药/kg时开始起效,且14 g生药/kg和28 g生药/kg抗抑郁效果较好。在有效剂量筛选时所选用的剂量5(1.75 g生药/kg)相当于逍遥丸临床人日服剂量,结果显示,在该剂量下,FFCGF并没有发挥抗抑郁作用。逍遥丸主要用于治疗疏肝健脾,养血调经,并未提及治疗肝郁脾虚型抑郁症所需剂量,本实验从侧面验证在该剂量(1.75 g生药/kg)下逍遥丸无抗抑郁作用,故本实验在进行药效验证时加入逍遥丸对照组来探讨逍遥丸发挥抗抑郁作用所需剂量及其与FFCGF发挥抗抑郁作用关系。因此在进行行为绝望模型来验证FFCGF抗抑郁药效时,加入了逍遥丸、文拉法辛作为空白对照。

实验中逍遥丸组所用剂量相当于FFCGF中剂量,逍遥丸表现出良好的抗抑郁作用,且抗抑郁疗效与FFCGF中剂量相似,说明FFCGF在逍遥散的基础上化裁去掉生姜、茯苓后的抗抑郁作用并未发生明显改变,证明了基于逍遥散化裁和提取工艺的优化而来的FFCGF具有重要开发价值。本实验中FFCGF中剂量与逍遥丸给药组剂量相当,相当于人日服逍遥丸248粒,说明逍遥丸发挥抗抑郁作用的剂量较大,FFCGF可以从服用剂量上发挥优势。

根据TST、FST实验结果显示,文拉法辛相较于逍遥丸和FFCGF在调节悬尾和强迫游泳引起的不动时间起效快,效果好等特点,但已上市药物文拉法辛有胃肠道不适、中枢神经系统异常、视觉异常、打哈欠、出汗和性功能异常等不良反应[24],后期应对FFCGF是否具有副作用,且与西药联合用药的“减毒增效”特点进行探讨。

本实验结果表明,联合用药组起效时间快于文拉法辛组,大鼠的穿越格数和直立次数在实验的第14天显著增加,且在糖水偏爱率的动态测定中平均值均高于文拉法辛,说明FFCGF与文拉法辛联合使用抗抑郁疗效优于文拉法辛,符合中西药联合用药“增效”的目的。联合用药组相较于阳性对照组文拉法辛在缓解CUMS应激状态下食欲不振、消化功能减弱引起的体重增长缓慢有较好的效果,文拉法辛有胃肠道不适等不良反应,侧面验证联合用药组在保证药效的前提下能够降低文拉法辛的副作用,在一定程度上符合中西药联合用药“减毒”的目的。