多种植物总酚含量和抗氧化能力的测定和比较分析

陈金祥,杨静,刘淑珍,姚静阳,郭彦鑫,王田田

(中北大学 化学工程与技术学院,山西 太原 030051)

0 引言

多酚是一类植物特有的多羟基次生代谢物,具有很好的抗氧化活性,根据是否含有C6-C3-C6母核结构,又分为黄酮类和非黄酮类两个亚类,其抗氧化能力强弱与酚羟基的数量和位置直接相关[7]。茶叶中的茶氨酸和茶多酚具有良好的抗自由基作用,作为三大饮品之一为人类健康做出巨大贡献,而茶叶生产中的边角料和老叶都可以成为茶多酚生产的原料。2006年,第一个以茶多酚为主要原料的植物处方新药(Veregen)被美国FDA批准,无疑为植物医药制剂的发展注入了新的活力[8]。1969年北京制药厂研制银杏黄酮制剂6911(舒血宁和冠也丽)是我国工业化植物多酚应用于医药行业的开始。银杏叶多酚提取物中黄酮含量超过25%(质量分数),主要活性物质为山柰酚,山柰酚可以通过抑制酒精对小鼠肝脏的氧化损伤来达到抗癌的作用[9]。葡萄籽多酚提取物中主要成分是低聚原花青素,它比松树皮和花生红衣多酚提取物中的高聚原花青素生理活性高[10]。葡萄和虎杖中的白藜芦醇能通过抑制氧化应激来有效地推迟小鼠糖尿病肾病引起的肾脏纤维化等功效[11],是保健品原料之一。悬钩子属植物中多种树莓、黑莓不仅是高营养价值的经济水果,还富含鞣花酸、花青素等高活性化合物,具有高多酚的特点,特别是红树莓叶片为少数含有槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的植物材料之一,槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷可以抑制胰腺癌细胞的迁移而达到抗癌的效果[12]。因此高总酚含量的植物材料具有很大的开发利用空间。

本文以药用[13]、药食同源、食叶植物和潜在植物源多酚植物为基础[14-15],选取5种茶叶、35种常用药材和树莓等[16]14种自制材料,共54种,通过使用福林酚法和铝盐显色法分别对总酚和总黄酮含量进行测定,用FRAP法测定其总抗氧化能力,用两种常用的DPPH法和ABTS法测定其清除自由基的能力,分析这些指标的相关性,为植物源多酚材料的选择和开发利用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

杠板归等35种植物药材购自山西省仁和大药房(2017-2018年);5种茶叶分别为六安瓜片(2017年,安徽)、翠尖茶(2018年,安徽)、碧螺春(2017年,安徽)、云南普洱茶(2012年,云南)、云雾茶(2017年、云南),树莓等14种植物材料为自制材料。14种自制材料均在自然条件下阴干至恒重:树莓、黑莓、草莓叶和银杏叶等11种材料采自山西太原北郊中北大学试验田(E111°,N37°,2018年);葡萄籽、石榴籽和核桃皮均于2018年购于市场。各植物材料拉丁名详见表1,全部标本保存于中北大学化学工程与技术学院植物质资源研究所。

芦丁、没食子酸、山柰酚、原花青素、木犀草苷、芹菜素、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)均购自合肥博美生物科技有限责任公司,批号分别为150806、150829、150828、150429、150919、150823、150616;2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)购自酷尔化学科技有限公司,批号分别为E5142535和54C1201V;福林酚试剂、过硫酸钾、硫酸亚铁、氯化铁等购自天津市申泰化学试剂有限公司。

Lamda 35 紫外可见光谱分辨仪(珀金埃尔默股份有限公司),KQ-250DE型超声清洗仪(昆山市超声仪器有限公司),TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)。

1.2 提取物制备

取干燥的植物材料粉碎,过40目筛子,准确称取0.1 g粉末,按照料液比为1∶40 g/mL加入4 mL体积分数60%乙醇溶液,混合摇匀,在超声清洗仪超声提取,超声条件为60℃、120 W、40 Hz、30 min,提取液于12 000 r/min离心10 min,上清液储藏于4℃冰箱备用[17]。

1.3 总酚标准曲线及含量测定

参考许海棠等[18]总酚含量测定方法,以质量浓度(X)对吸光度(Y)进行回归,没食子酸为标准品进行标准曲线绘制。没食子酸在0.05～0.25 mg/mL内线性良好, 回归方程为:Y=1.809X+0.006,R2=0.998。对各植物提取液进行测定,并按标准曲线方程计算出总酚含量,总酚含量单位mg/g。

1.4 总黄酮标准曲线及含量测定

参考韩红娟等[19]总黄酮含量测定方法,以质量浓度(X)对吸光度(Y)进行回归,芦丁为标准品进行标准曲线绘制。芦丁在0.01-0.06 mg/mL内线性良好,回归方程为:Y=13.334X+0.001,R2=0.999。对各植物提取液进行测定,并按标准曲线方程计算出总黄酮含量,总黄酮含量单位mg/g。

1.5 总抗氧化能力测定

参考Katalinic等[15]总抗氧化能力/铁离子还原(Ferric ion reducing antioxidant power, FRAP)测定方法,以摩尔浓度(X)对吸光度(Y)进行回归,硫酸亚铁为标准品进行标准曲线绘制。硫酸亚铁在0.02～0.12 μmol内线性良好,回归方程为:Y=5.114X+0.140 2,R2=0.999。对各植物提取液进行测定,并参照硫酸亚铁标准曲线,计算出铁离子还原量,以铁离子还原量表示总抗氧化能力。单位:μmol。

1.6 DPPH自由基清除能力测定

参考Piangsiong等[20]DPPH·清除能力测定方法,以体积分数95%的乙醇溶液为空白调零,2 mL提取液与2 mL DPPH·反应液混合,避光反应40 min,在510 nm测得的吸光度记为A1,体积分数60%乙醇溶液(或者无样品的溶剂)与DPPH·反应液混合后测得的吸光度记为A2,计算清除率,公式为:清除率(%)=(1-A1/A2)×100%。

1.7 ABTS自由基清除能力测定

参照Rodriguez-Bonilla等[7]ABTS自由基清除能力测定方法,以体积分数70%乙醇溶液为空白调零,1 mL提取液与3 mL ABTS反应液混合,避光反应6 min,测得的吸光度值记为A1,体积分数60%乙醇(或者无样品的溶剂)与ABTS反应液混合测得吸光度值为A2,计算清除率,公式为:清除率(%)=(1-A1/A2)×100%。

1.8 数据处理

数据采用SPSS 19.0进行单因素方差分析和线性回归分析,采用Origin 8.5进行数据拟合作图。

2 结果与分析

2.1 54种材料的总酚含量和分组

参照Katalinic等[15]的方法,按照总酚含量将54种材料分为5组(如表1)。A组(极高总酚组):总酚含量>200 mg/g, 4种绿茶,这与茶叶富含茶多酚,具有抗氧化的健康价值研究结果一致[21]。B组(高总酚组):总酚含量100～200 mg/g,包括8种植物材料。杠板归、石榴皮和荷叶属于已被大量使用的药用材料,兼顾药用价值和高总酚特点。杠板归、荷叶和树莓一样是少数几种含有槲皮素-3-O-葡萄糖醛酸苷的植物[12],另外,荷叶提取物的总抗氧化能力远大于维生素E[22]。葡萄籽总酚含量在100 mg/g以上,具有很强的抗氧化能力,葡萄籽提取物以原花青素为主,其铁离子还原能力是人工抗氧化剂2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol,BHT)的10倍以上[23]。C组(中总酚组):总酚含量50～100 mg/g,包括11种植物材料,7种为药用材料。银杏叶片总酚和总黄酮的排序不高,可能与所收集叶片的采收期采收地有关,也与银杏黄酮主要成分是山柰酚,在铝盐显色法中效果不好有关[9]。D组(低总酚组),总酚含量10～50 mg/g,包括28种植物材料,23种为药用材料,这些中药材有特定的药理作用和相应的化合物组分,可能与高总酚关系不大。红树莓鲜果、黑莓和红树莓种子、爬山虎和草莓叶片5种普通植物材料的总酚含量也不高,不太适合作为提取多酚的首选材料。E组(极低总酚组):总酚含量<10 mg/g,包括3种植物材料。柴胡和白果是常用中药,从测定结果看也不以总酚含量高见长。石榴籽看上去和葡萄籽类似,但是总酚含量远不如葡萄籽,也不适合提取多酚用。本试验选取的54种植物与刘海英等选取的86种药食两用的药材具有部分的重叠,例如甘草、泽兰叶、紫苏叶等,其总酚含量与试验结果类似[14]。总体来看,B组材料的总酚含量在100 mg/g以上,虽然不能与直接食叶用的茶叶总酚相比,但是可以作为潜在的植物多酚提取材料,特别是药用以外的黑莓和红树莓叶片和核桃壳,它们类似于葡萄籽都属于农副产品废弃物,具有变废为宝的开发价值和大规模产业化开发的潜质。

表1 54种植物材料总酚及其他指标汇总

表2 各个指标间显著性分析

图1 总酚含量与总抗氧化能力(FRAP)线性拟合图Fig.1 Linear correlation between the amount of total phenolic content and antioxidant capacity (FRAP)

2.2 54种植物总酚含量与总抗氧化能力比较分析

2.2.1 总酚与铁离子还原量相关性分析

各植物材料提取液的抗氧化能力经由FRAP法测得,总酚与各抗氧化能力相关性分析如表2所示,总酚含量与铁离子还原量(μmol)显著相关(P<0.01),其中相关因子,r=0.987。将总酚含量(X)与铁离子还原量(Y)进行线性拟合,拟合曲线如图1所示,拟合方程为:Y=0.104X-0.622,R2=0.977,拟合结果相关性高。Katalinic等[15]通过对克罗地亚当地药店购买70种药用植物的总酚含量和FRAP(μmol/L)进行相关性分析,发现的总酚含量和铁离子还原量具有显著的相关性,且拟合曲线r>0.95;值得一提的是,黑莓叶片和红树莓叶片的总酚含量分别排在第四和第九位,均属于高总酚组和高FRAP组,这些结果与本试验结果相似。另外,从种属的角度分析,除了山茶科山茶属的茶叶制品基于高多酚含量表现出高的抗氧化活性外,蔷薇科悬钩子属的红树莓和黑莓具有次高多酚含量和抗氧化活性,其他种属植物作为植物多酚来源的优势不足。

2.2.2 总酚与自由基清除能力相关性分析

各植物材料的提取液自由基清除率经由DPPH法和ABTS法测得。总酚与自由基清除能力相关性分析如表2所示,总酚含量与自由基清除率(%)显著相关(P<0.01),但其相关因子分别为r=0.738和r=0.769,明显低于总酚与FRAP的相关性。这可能与总酚的测定主要依赖福林酚显色法,与FRAP的铁离子还原法机制类似,两者均为多酚化合物还原金属离子显色法。

多酚类化合物清除自由基的DPPH法和ABTS法,由于自由基本身不稳定,而容易受到如温度、pH、反应时间、溶剂、电离电势等[24]多重因素的影响。例如:有机酸通过影响提取液的pH来影响自由基清除能力,pH对多酚类化合物清除自由基能力有很大的影响,随pH增加多酚电离出多酚阴离子[24],多酚阴离子清除自由基的机制为单电子转移(single electron transfer,SET),比多酚更容易给出电子[25]。其次,有机酸会与多酚类化合物具有协同清除自由基作用,反式乌头酸、柠檬酸等有机酸的加入会增强多酚类化合物清除DPPH·的能力[20]。自由基加合物的生成使得某些还原能力不强的化合物在测定值上反而反映出更高的自由基清除能力,Tai等[26]发现-分子熊果苷基于氢原子转移(hydrogen-atom transfer,HAT)机制消除-分子ABTS·+之后,反应产物又以自由基加合物(radical adduct formation,RAF)机制清除了两分子的ABTS·+;同样的,抗坏血酸-2-O-葡萄糖苷与DPPH·生成加合物,使得其自由基清除能力远优于比其抗氧化能力强的抗坏血酸[27]。自由基链式反应的复杂性,导致多酚类化合物与DPPH·和ABTS·+的反应产物多种多样[28]。而我们的醇提混合物中并没有考虑到各个植物材料之间的有机酸、 pH值和其他差异。因此,总酚与DPPH·和ABTS·+的清除率的相关性略逊于总酚含量和FRAP之间的相关性,但是总体上自由基清除率随总酚含量增加而增加。

2.3 总酚与总黄酮含量相关性分析

黄酮类化合物属于多酚类化合物的一个分支,原则上总黄酮与总酚含量应该正相关,显著性分析结果显示P<0.05,存在相关性,但是相关因子,r=0.545(如表2)。如表1所示,杠板归、葡萄籽、秦皮和党参等都出现高黄酮低总酚的情况,原因可能是总酚含量的测定利用SET机制[29],以没食子酸为标准品,样品的总酚含量不仅与酚类物质浓度有关,还与酚类物质的给电子能力有直接关系[27]。而总黄酮含量的测定则利用络合显色机制,以芦丁为标准品,根据铝盐显色法的显色机制,该体系仅对具有邻苯二酚结构的化合物在510 nm处有较强的吸收峰[30]。分别以芦丁、山柰酚、原花青素、木犀草苷和芹菜素五个标准品采用铝盐显色法单独显色后,并对其进行全波长扫描。结果发现,不具有邻苯二酚结构的黄酮类化合物山柰酚和芹菜素(如图2a-b)在510 nm左右不具有吸收峰;具有典型邻苯二酚结构的黄酮类化合物虽然在510 nm处有吸收峰,但吸收峰高不同,依次为木犀草苷<原花青素<芦丁(如图2c-e)。不具有黄酮类化合物的基本结构的原儿茶酸也可在该体系中显色,且具有强吸收峰。鉴于以上三种情况,总黄酮的铝盐法测定结果受化合物结构影响较大,因此与总酚含量有相关性,但拟合效果不好。

a-山柰酚;b-芹菜素;c-木犀草苷;d-原花青素;e-芦丁图2 5种黄酮铝盐显色后全波长扫描图a-Kaempferol;b-Apigenin;c-Luteolin 7-O-β-D-glucoside;d-Proanthocyanidins;e-RutinFig.2 Full-wavelength scan of 5 kinds of flavonoid by aluminum salt method

总黄酮含量与总抗氧化能力(FRAP)显著相关(P<0.05),但相关因子较低,r=0.493。原因可能为,黄酮类化合物受pH影响较大,对多酚氧化酶较为敏感,容易被降解失去活性[24]。碱性条件下黄酮类化合物会分解为小分子酚酸等多酚类化合物,而酚酸类化合物的抗氧化活性较黄酮类化合物会有明显的减弱[31]。同时本试验受测定方法的限制,使得一些具有抗氧化活性的黄酮类化合物不能被检测到,例如山柰酚具有很强的抗氧化活性,但山柰酚在铝盐显色法中没有吸收峰,而银杏叶中的主要多酚类物质为山柰酚[9]。因此,总黄酮含量与抗氧化活性的相关性还与植物材料中含有的黄酮类化合物的种类有很大关系,影响了其二者的相关性。

3 结论

本试验对54种植物材料总酚和总黄酮含量、总抗氧化能力、DPPH·和ABTS·+清除能力进行测定和相关性分析。以总酚含量为基础将被试材料分为5组,A、B两组植物材料总酚含量均高于100 mg/g,具有很强的抗氧化能力;基于相似的测定机制总酚含量与总抗氧化能力(FRAP)显著相关,线性拟合度高,r=0.987;但是由于自由基自身性质、pH、显色机制等因素,总酚与自由基清除能力和总黄酮含量有相关性,但拟合度低。尽管如此,高总酚含量仍对应高抗氧化性。本试验为各植物材料进一步的研究与应用打下基础,蔷薇科植物黑莓叶片、红树莓叶片和胡桃科核桃种皮均为农产品生产的副产物,可以作为变废为宝的潜在植物多酚提取原料,为我国十三五计划的建设“健康中国”服务。