高灵敏化学发光酶联免疫检测技术检测祛痘类化妆品中的氟喹诺酮类抗生素

李启艳，于海英，胡德福，孙德军，崔基炜

(1 山东省食品药品检验研究院，山东 济南 250101；2 山东大学化学与化工学院，山东 济南 250100)

喹诺酮类(quinolones,QNs)药物是一类人工合成的含 4-喹诺酮母核的药物，是近年来迅速发展起来的新一代高效、广谱抗菌药物。这类药物的基本结构为 1,4-二氢-4-氧代吡啶-3-羧酸，其结构见图 1。在母核结构的 1、5、6、7、8 位加上不同的基团，即构成不同的 QNs。且母环两个环基本上处于同一个平面。

喹诺酮类主要用于细菌治疗所致的呼吸道、咽喉、皮肤及软组织的急、慢性感染，使用含有喹诺酮类的化妆品，短期内会产生祛痘、抗粉刺的作用，如果长期使用，会引起接触性皮炎、抗生素过敏等症状，易产生耐药性；药物残留还可能导致全身过敏反应等，原国家食品药品监督管理总局已将氧氟沙星列为化妆品中禁止添加成分。

对喹诺酮类的残留检测一直是研究人员关注的重点，目前对喹诺酮类的检测技术较多，主要是快速检测和仪器检测技术。其中快速检测技术主要是酶免疫分析技术[1-3]，仪器检测技术主要包括高效液相色谱(HPLC)[4-5]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)[6-8]，仪器检测技术具有较高的灵敏度和准确度，通常作为氟喹诺酮类抗生素的确证检测技术而广泛应用。然而仪器检测技术需要昂贵、精密的仪器设备，而且对样品的预处理和操作人员的要求较高，不利于用于大量样品的检测和现场的快速检测。基于抗压抗体特异性识别的快速检测技术则不受这些条件的限制，尤其是酶免疫分析技术以其快速、高通量等优点被广泛用于氟喹诺酮类抗生素的快速筛查研究。

基于抗体的酶联免疫分析与化学发光检测技术相结合建立化学发光酶联免疫检测技术(Chemiluminiscence enzyme-linked immunosorbent assay，CL-ELISA)，该方法能够大大地提高检测方法的灵敏度，目前主要用于检测水产品以及动物源性食品中的氟喹诺酮类抗生素，而在化妆品中的检测尚未见相关报道。本研究建立了基于氧氟沙星包被原、酶标抗氧氟沙星族特异性单克隆抗体的检测祛痘化妆品中氟喹诺酮类抗生素的高特异性直接竞争CL-ELISA检测技术，样品提取采用超声辅助磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)提取，提取技术简便，易于操作。采用直接竞争CL-ELISA方法进行检测，一方面反应过程无需加入酶标二抗的反应步骤，节省了反应时间，另一方面，采用化学发光底物进行检测，提高反应的灵敏度。本方法快速、灵敏、重复性好，可用于祛痘类化妆品中氟喹诺酮类抗生素的检测。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂 氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星均购于美国Sigma公司；氧氟沙星包被原、酶标抗氧氟沙星单克隆抗体由北京泽扬生物科技有限公司提供；SuperSignal化学发光底物购于美国Pierce公司；其他试剂均购于国药集团化学试剂有限公司。

微量可调移液器购于德国Eppendorf公司；不透明化学发光酶标板购于美国Costar公司；Veritas微孔板发光检测仪购于美国Turnet Biosysterm公司；恒温培养箱购于上海精密试验设备有限公司。

1.2 制备抗体标记物

1.2.1 使用高碘酸钠(NaIO4)对辣根过氧化物酶(HRP)进行活化。

1.2.2 将活化后的辣根过氧化物酶与氧氟沙星抗体IgG进行偶联反应。

1.2.3 加入NaBH4饱和甲醇溶液中进行还原反应，获得辣根过氧化物酶-氧氟沙星抗体标记物。

1.3 直接竞争CL-ELISA程序

1.3.1 包被：每孔加入按一定比例包被缓冲液(0.05 mol·L-1,pH 9.6 的碳酸盐缓冲液)稀释好的包被原100 μL，37 ℃包被 2 h，倒出孔内液体，用洗涤液(含0.05%磷酸盐缓冲液)洗涤3遍，拍干。

1.3.2 封闭：每孔加入封闭液(5%小牛血清) 200 μL，37 ℃孵育 1 h，倒出孔内液体，洗涤液洗3遍，拍干备用。

1.3.3 竞争反应：每孔加入 50 μL 氧氟沙星标准品(或前处理后的样品)，再加入50 μL PBS稀释的酶标氧氟沙星单克隆抗体混匀后室温孵育 60 min，倒出孔内液体，洗涤液洗5遍，拍干。

1.3.4 测定：每孔加入 100 μL 发光底物SuperSignal(发光底物现用现配)，摇动使之均匀孵育 2 min后用化学发光测定仪测定化学发光强度(relative light units,RLU)。

1.4 标准储备液及标准曲线的绘制 准确称取氧氟沙星标准品10 mg，置于10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，储备液终浓度为1 mg·mL-1，4 ℃保存备用。

取储备液100 μL，加PBS稀释至1 000 ng·mL-1作为起始浓度，依次做3倍稀释，配置标准工作溶液，共10个浓度，按照“1.2”进行操作，绘制氧氟沙星标准曲线。

每个浓度对应的发光值除以最大的发光值(未加入标准品时)(B/B0)所得到的值为纵坐标，以标准品浓度的对数为横坐标，用软件 Origin8.0 绘制标准曲线，建立四参数回归方程。回归方程为：

Y={(A-D)/[1+(X/C)B]}+D

其中A和D分别代表无药物和本底分别对应的值，B为曲线拐点处的斜率，C 为半数抑制率，即IC50，是方法的主要参考参数，方法以IC10作为检测限(limit of detection,LOD)，IC20～IC80为方法的检测范围。

1.5 特异性试验 选择氧氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等氟喹诺酮类似物作为竞争物，参照上述方法进行直接竞争CL-ELISA检测，分别计算IC50值，计算交叉反应率(cross reactivity,CR)。

交叉反应率(%)=(抑制50%氧氟沙星的浓度/抑制50%的氧氟沙星类似物浓度)×100%

1.6 待测样品的前处理 称取祛痘化妆品试样1.00 g(精确至 0.01 g)于 50 mL离心管中，加入10 mL PBS，涡旋震荡30 s，然后在超声清洗仪中超声3 min充分提取，静置后取部分溶液置于 2 mL离心管中，4 ℃ 12 000 g·min-1离心10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜待测。

1.7 准确度精密度研究 向空白样品中添加氧氟沙星标准品至终浓度为 5、20和100 ng·mL-1。每个浓度添加的样品做5个平行，连续做3 d，样品按上述方法操作测定发光值，根据标准曲线计算出样品中氧氟沙星含量，并计算添加回收率，计算日内和日间变异系数。

2 结果和讨论

2.1 最佳包被原和酶标抗体稀释度确定 采用方阵法测定，将包被抗原倍比稀释成不同的浓度进行包被酶标板，每孔 100 μL，酶标氧氟沙星 单克隆抗体倍比稀释成不同浓度加入酶标板，不加入包被原作为空白对照，按照上述直接竞争CL-ELISA方法进行测定，结果见表1。

表1 包被原和抗体最佳稀释倍数研究

注：表中数据均是科学计数法省略的表示，如 3.88 原型为 3.88×106，为了简便且便于比较，只保留整数部分

由表可知，包被原浓度较高时，其浓度降低对发光值的影响不大。当包被原稀释度为 1∶8 000时的发光值读数稳定，当稀释倍数大于8 000，发光值下降幅度较大，表明包被原在1∶8 000 稀释度下可以与抗体进行充分的反应，因此选择1∶8 000为包被原最佳稀释度。抗体稀释倍数过小会导致发光值过大，不利于竞争反应，而抗体稀释倍数过大则会导致发光值偏小，读数波动大，结果不稳定。综合以上各种因素，确定包被原的稀释度为 1∶8 000，抗体的最佳稀释度为 1∶100 000。

2.2 竞争反应中标准品与抗体的比例的确定 分别设定不同的标准品与抗体比例进行竞争反应，比例设定为 30∶70、50∶50、70∶30 三组，按照上述程序进行检测，绘制标准曲线，分别计算 IC50值及RLU max/IC50比值，结果见表2。由表可知标准品与抗体体积比为 50∶50 时，灵敏度最高，3组RLU max /IC50值差别不大，因此选择标准品与抗体比例为50∶50。

表2 标准品与抗体比例研究

2.3 标准曲线、检测限和检测范围 按照“1.3”项下的方法绘制标准曲线，结果见图2，曲线方程为：

Y={(0.936 2-0.051 3)/[1+(X/18.652 3)0.9214]}+0.051 3

本方法的IC50为18.652 3 ng·mL-1，检测限LOD(IC10)为2.0 ng·mL-1，检测范围(IC20～IC80)为4.1～104.6 ng·mL-1。

2.4 特异性 选取与氧氟沙星结构相似的恩诺沙星、环丙沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星、沙拉沙星等其他化合物进行方法特异性研究(结果见表3)。由表可知，本方法对氟喹诺酮类抗生素有较好的交叉反应12.5%～128.6%，可用于氟喹诺酮类的检测。

表3 交叉反应率测定结果

2.5 准确度和精密度 准确称取空白化妆品1.00 g，添加氧氟沙星标准品至终浓度为 10、20和100 ng·g-1，涡旋震荡混匀，按照所建立的CL-ELISA方法进行检测，结果见表4。平均回收率范围在82.7%～99.6%，日内变异系数低于9.8%，日间变异系数低于8.2%。

表4 祛痘化妆品中氧氟沙星准确度精密度测定

2.6 实测样本 采集当地祛痘类化妆品20份，样品经本研究所建立的方法进行检测，结果共检测到3个样品氟喹诺酮类抗生素呈阳性，浓度分别为14 ng·mL-1，18 ng·mL-1和11 ng·g-1，阳性率15%。

3 结论

本方法中改良的高碘酸钠法采用饱和NaBH4甲醇溶液进行还原反应，克服了NaBH4水溶液极易被氧化、不能长期保存的缺点，从而避免了该溶液现用现配的限制；直接竞争化学发光免疫检测技术提高了检测效率和检测的灵敏度；采用高灵敏的鲁米诺化学发光底物替代传统的TMB底物，极大程度地提高了反应的灵敏度；通过建立工作曲线可以快速、准确地得到氟喹诺酮类抗生素残留的浓度，降低了检测和计算的复杂程度，适用于广泛的基层检测工作的应用。