清血八味片对高脂血症金黄地鼠血脂的影响及其机制

孙梦佳，杜海涛，苏丽红，董梅月，于鹏飞，蒋海强

(1.山东中医药大学药学院，山东 济南 250355；2.青岛优抚医院，山东 青岛 266000；3.内蒙古蒙奇药业有限公司，内蒙古 呼和浩特 011700；4.山东中医药大学实验中心，山东 济南 250355)

高脂血症 (hyperlipidemia,HLP) 是一种脂质代谢异常性疾病,表现为血浆中一种或几种脂质紊乱,包括血浆胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平升高或 (和) 高密度脂蛋白胆固醇水平过低[1]。高脂血症是动脉粥样硬化和冠心病的主要发病因素。近年来,随着我国经济的快速发展,生活习惯和饮食习惯的改变等多种因素的影响,我国的高脂血症患者数量急剧增加[2-3]。临床治疗上采用西药的疗效比较显著,目前常用于临床降血脂的西药有:他汀类、贝特类、胆酸螯合剂、烟酸类等[4]。这些降血脂药物虽然可以有效、快速地降低血脂,但是长期服用降血脂药物副作用较多，比如腹胀、腹泻、肌无力、肌肉溶解等不良反应[5]。因此,本研究意在从传统制剂清血八味片中发现其降血脂作用，寻求一种安全、有效、不良反应小的降血脂的方法。

蒙医药是我国医药学重要的组成一部分，其研究越来越受到大家的关注。清血八味片(蒙名:琪孙黑木拉-8)是常用的蒙医药复方制剂,源自《甘露四部》,该处方是由寒水石、紫草、土木香、人工牛黄、栀子、瞿麦、石膏、甘草8味中药材组成,具有清讧血药效作用，可用于治疗血可热头痛，口渴目赤，中暑等疾病[6]。八味药材配伍得当,牛黄活血，紫草、栀子、石膏、寒水石等凉血，土木香行气，瞿麦利水，甘草调和主要，奏活血凉血、通络解毒之功,可畅通心脑血管,排泄代谢废物、毒素等,从而恢复血液循环系统平衡[7]。本实验通过高脂饲料喂养金黄地鼠制作高血脂动物模型，以清血八味片不同剂量进行干预，从而从动物模型层面探讨该药的降血脂药效。

1 材料

1.1 实验动物 SPF级雄性金黄地鼠72只，体重(110±5)g，购自北京维通利华有限公司，许可证号:SCXK(京)20160011。实验动物饲养于山东中医药大学实验动物中心,实验动物使用许可证号为SYXK(鲁)2017-0022,人工光循环12 h/12 h,温度为(24±2.0)℃,湿度为55%±5%。动物实验流程遵循山东中医药大学有关实验动物保护和使用的指南,并经山东中医药大学实验动物福利伦理委员会批准。

1.2 药品与试剂 清血八味片(500 mg/片，内蒙古蒙奇药业有限公司，生产批号：20170706)；阿托伐他汀钙片(立普妥，20 mg/片，辉瑞制药有限公司，生产批号：X07611)；总胆固醇检测试剂盒(批号：2018051601)、甘油三酯检测试剂盒(批号：2018081001)、高密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(批号：2018072701)、低密度脂蛋白胆固醇检测试剂盒(批号：2018080602)，以上试剂盒均由宁波瑞源生物科技有限公司生产。

1.3 仪器 卓越310全自动生化分析仪(上海科华实验系统有限公司)；CP225D电子分析天平(德国Sartorius公司)；高速离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。

1.4 高脂模型饲料 参照保健食品辅助降血脂动物试验混合型高血脂造模方法[8]， 在维持饲料中添加20.0%蔗糖、15%猪油、1.2%胆固醇、0.2%胆酸钠,适量的酪蛋白、磷酸氢钙、石粉等。除了粗脂肪外,模型饲料的水分、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、粗灰分、钙、磷、钙∶磷均达到维持饲料的国家标准。高脂模型饲料和维持饲料均由北京科澳协力饲料有限公司提供(批号：19043211)。

2 试验方法

2.1 动物的分组 金黄地鼠72只，适应性饲养7 d,分为正常组(12只)和高脂模型组(60只)。造模后根据TC水平将高脂造模组60只大鼠随机分为模型组、阳性对照药组、清血八味片低剂量组、清血八味片中剂量组、清血八味片高剂量组，每组12只。

2.2 高脂血症动物模型制备 正常对照组饲喂维持饲料，高脂模型组饲喂高脂模型饲料。每日补充饮水及饲料,保持实验动物生活环境干燥、清洁、通风。连续喂养2周,眼眶静脉取血,分离血清,置-80 ℃冰箱保存备用,测定血清中Tch、TG、LDL-C水平。

2.3 动物的分组给药 经过查阅相关实验动物文献[9]，根据临床剂量折算，确定金黄地鼠给药剂量为阿托伐他汀钙片2.31 mg·(kg·d)-1，清血八味片低剂量为175 mg·(kg·d)-1,中剂量为350 mg·(kg·d)-1，高剂量为525 mg·(kg·d)-1。药物以0.9%氯化钠溶液超声溶解,各组均灌胃给药。正常组和模型组灌胃给予0.9%氯化钠溶液。

2.4 样本采集及指标检测 造模成功后,进行高脂血症治疗实验,同时分别给药,同时给予高脂饲料。给药2周后于眼眶静脉取血监测Tch、TG、HDL-C、LDL-C水平,判断模型的保持与否并对药效学进行推断；第四周腹腔静脉采血，3 000 rpm离心15 min，取血清测定血脂的Tch、TG、HDL-C、LDL-C水平，观测清血八味片干预的药效作用，严格按照试剂盒说明书操作。

3 实验结果

3.1 高脂血症模型造模结果 正常组与高脂模型组随机选取动物，造模2周后眼眶静脉取血进行全自动生化分析，检测结果如表1，与正常对照组比较,高脂模型组的Tch、TG、LDL-C均显著升高(P<0.05)，表示高脂血症造模已成功。

3.2 清血八味片干预2周后血脂指标测定 清血八味片干预2周后，与正常组相比，模型组Tch、TG、LDL-C水平升高(P<0.05)，HDL-C水平降低(P<0.05)。与模型组相比，阳性药组的TG水平下降(P<0.05)；低剂量组的Tch、TG水平均出现下降的趋势， HDL-C水平升高(P<0.05)；中剂量组的Tch、TG水平降低(P<0.05)，HDL-C水平升高；高剂量组的Tch、TG水平均出现下降的趋势， HDL-C水平升高(P<0.05)，具体结果见表1。

3.3 清血八味片干预4周后血脂指标测定 如表2所示，干预四周后，与正常组相比，模型组Tch、TG、LDL水平升高，HDL-C水平降低，具有显著性差异(P<0.05)。与模型组相比，阳性药组，TG水平下降，HDL-C水平升高，具有显著性差异(P<0.05)；低剂量组Tch、TG、LDL-C水平下降，HDL-C水平升高，具有显著性差异(P<0.05)；中剂量组Tch、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，具有显著性差异(P<0.05)；高剂量组Tch、TG、LDL-C水平降低，HDL-C水平升高，具有显著性差异(P<0.05)。

表1 清血八味片干预两周后血脂水平结果

注：与正常组比较，◇P<0.05；与模型组比较，※P<0.05

表2 清血八味片干预四周后血脂水平结果

注：与正常组比较，◇P<0.05；与模型组比较，※P<0.05

3.4 清血八味片对各组大鼠肝脏质量及其肝脏指数的影响 给药结束时,与正常组相比，模型组金黄地鼠的肝脏质量及肝脏指数 (肝重/体质量) 显著升高；与模型组相比，阳性药组的肝脏质量及肝脏指数显著下降；清血八味片中、高剂量组金黄地鼠的肝脏质量及肝脏指数显著降低；低剂量组的肝脏质量及肝脏指数出现下降趋势，但无显著性差异，见表3。

表3 各组金黄地鼠肝脏质量、肝脏指数比较

注：与正常组比较，◇P<0.05；与模型组比较，※P<0.05

4 结论与讨论

本实验综合以上4周后血脂结果可以看出清血八味片具有降低高脂饲料诱导的高脂血症金黄地鼠血脂的功效。给药两周后，高中低3个剂量组均出现Tch、TG、HDL-C、LDL-C的调控作用，给药4周后，调控趋势更为明显。阳性对照药侧重调控TG，而清血八味片对总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白均有调控作用，说明了中药的整体调节作用。清血八味片治疗高脂血症金黄地鼠过程中，阳性药组死亡1只，低剂量组死亡3只，中剂量组死亡2只，高剂量组死亡2只，根据原本每组12只的数据，说明4周的给药过程中具有一定的副作用,建议开展长期毒性实验。

研究高血脂可以选择的动物模型有许多。灵长类动物的脂代谢生理病理过程最接近人类，但其代价过高，来源有限。啮齿类动物大鼠小鼠对胆固醇有先天性耐受力，其造模过程比较长，且内源性胆固醇合成量与人类的差异较大，并且胆固醇的血浆清除率明显高于人类，因此动物实验结果外推到人体会有一定的限制。内源性胆固醇人类合成量1～10 mg·kg-1，而大小鼠每天约合成150 mg·kg-1，超过人类的十倍。它们与人类胆固醇合成虽有较大差异，但是Wistar 大鼠对降脂药的作用更为敏感，适合降脂血脂药物的发现。兔子是食草性动物，易拒绝动物性脂肪饲料。基因缺陷性动物使用成本更高，操作复杂且周期长。相对而言，金黄地鼠胆固醇肝外合成比例约为85%，在胆固醇和代谢方面，以及受体与非受体转运途径的比例与人类类似，且该模型对食物中脂质以及调节血脂功效成分的反应更加接近人类，因此血脂研究选用金黄地鼠具有必要性。

清血八味片是以蒙医药理论为基础研制而成，方中紫草、栀子和瞿麦为清血主药,紫草味甘、咸、寒,归心,肝经,功能清热凉血,活血,解毒透疹,在《神农本草经》和《本草纲目》中均有记载[10]。紫草的主要活性成分紫草素及其衍生物具有抑制血小板聚集等作用[11]。栀子中的西红花苷及其代谢物藏红花酸明显具有抑制胰脂酶的活性,进而抑制脂肪和胆固醇的吸收,从而发挥降血脂功效[12]。牛黄成分之一的牛磺酸可抑制心室肌细胞钙内流,减轻细胞钙超载,能对抗肾上腺素、地高辛和洋地黄诱发的心律失常[13]。同时,抑制血管平滑肌细胞增生和内膜增厚,抗高血压和抗动脉粥样硬化,降低血脂,抑制血小板凝集与血栓形成,保护心肌,抗心力衰竭[14]。石膏的主要成分为CaSO4·2H2O,还含有Fe、Cu、Mg、Al、Ti、Sr等多种微量元素,内服经胃酸作用,一部分变为可溶性钙盐,至肠吸收后可增加血钙离子浓度,进一步抑制神经应激反应、减轻血管通透性,故可以发挥清热泻火、除烦止渴等功效[15]。寒水石的主要成分为CaSO4·2H2O,经凉制后失去结晶水，寒水石具有清热泻火、除烦止渴的功效,经凉制后可治疗血热病并有活血化瘀的作用[16]。现代药理研究表明,甘草中含有甘草酸,甘草酸肌内注射对实验性高脂血症家兔有明显的降脂作用,可使血浆Tch和TG含量明显下降,减轻动脉粥样硬化的程度[7]。本次实验发现清血八味片明显的降血脂作用，尤其是降低Tch、TG、LDL-C，升高HDL-C，应是清血八味片治疗讧血症机理的一部分。