宿主细胞利用异噬防御细菌感染的研究进展

张春晨

摘要  自噬是一种进化上古老且高度保守的真核生物机制，该机制在维持细胞稳态和应对各种环境条件方面起着至关重要的作用。异噬属于自噬的一种，由于其主要吞噬和降解的对象为入侵病原体，故将其称为异噬。在分子水平上综述了不同细菌入侵细胞后触发的细胞异噬清除机制及其在国内外的研究进展。

关键词  自噬;异噬;细菌感染;抗菌免疫

中图分类号  Q25文献标识码  A

文章编号  0517-6611（2020）04-0008-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2020.04.002

开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Advances in Research on Host Cells Using Xenophagy to Protect against Bacterial Infection

ZHANG Chun-chen  （School of Biotechnology and Food Science，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134）

Abstract  Autophagy is an evolutionarily ancient and highly conserved eukaryotic mechanism that plays a vital role in maintaining cell homeostasis and coping with various environmental conditions.Xenophagy is a kind of autophagy，which is called a xenophagy because its main phagocytosis and degradation are invading pathogens.At the molecular level，we reviewed the mechanism of cellular xenophagy clearance triggered by different bacterial invading cells and its research progress at domestic and foreign.

Key words  Autophagy;Xenophagy;Bacterial infection;Antibacterial immunity

异噬（xenophagy）是Levine在2005年正式提出的概念[1]，属于宿主细胞自噬（autophagy）作用的一种，由于主要吞噬和降解的对象为入侵病原体，故将其称为异噬。自噬被认为是一种进化上保守的真核生物机制，真核细胞可利用其将自身胞质蛋白或细胞器等组分降解以维持细胞内的稳态环境[2-4]。与泛素-蛋白酶体降解系统不同，自噬可以降解相对较大的底物，包括蛋白质聚集体，细胞器或入侵病原体等[1]。在营养缺乏条件下，细胞通过自噬降解蛋白质和其他大分子，从而为自身合成代谢提供必需的营养物质[5-6]。此外，自噬还可在缺氧、氧化应激以及辐射等条件下被诱导[9]。

根据自噬降解方式的不同，其可分为3种类型：分子伴侣介导的细胞自噬（chaperone-mediated autophagy，CMA），微自噬（microautophagy）和巨自噬（macroautophagy）。CMA是由热休克蛋白（HSC70）介导的在溶酶体中降解细胞溶质蛋白的选择性自噬降解过程[7];微自噬是通过溶酶体膜的内陷直接将临近细胞质摄入溶酶体内，从而将所摄入内容物降解[8];而巨自噬为溶酶体与含有待降解物的囊泡融合进而将其内组分降解，其中涉及细胞内多种组分，例如多肽、细胞器、细胞内蛋白聚集体和病原体等，宿主细胞通过巨自噬降解入侵病原体的过程又称为异噬作用[9]。

在病原体入侵细胞之初，宿主细胞膜上Toll样受体（Toll-like receptors，TLR）可对不同微生物病原体相关模式分子（pathogen-associated molecular patterns，PAMP）进行识别，从而引发异噬。在侵入细胞后，病原体经泛素化信号通路被泛素化，之后在衔接蛋白（p62、NDP52和NBR1等）的作用下被募集至异噬体中，后者与溶酶体融合形成异噬溶酶体从而将病原体降解。不同微生物被异噬作用降解的分子机制略有不同，该研究综述了侵入性细菌，例如结核分枝杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、福氏志贺氏菌和化脓性链球菌等通过宿主异噬防御机制被清除的分子机制。

1  宿主細胞利用异噬防御细菌感染的分子机制

1.1  结核分枝杆菌诱导的异噬机制

结核分枝杆菌是第一个被鉴定出能够诱导异噬的细菌[11]。研究表明，在感染巨噬细胞初期，结核分枝杆菌仍可在宿主细胞的吞噬泡内存活。随着细菌的增殖，吞噬泡形成异噬体的过程受到抑制，阻碍了异噬体与溶酶体的融合从而阻断异噬流[12]。但在各种外源性刺激的诱导下异噬作用仍会发生，例如营养缺乏、Toll样受体（TLR）[13]信号传导、干扰素（IFN）-γ[11]、雷帕霉素[14]和维生素D的作用[15]等。这些外源性刺激通过促进吞噬泡酸化有效地增强了异噬作用，从而抑制巨噬细胞中结核分枝杆菌的繁殖。此外，即使没有外源刺激，在感染后期大约30%的细菌也能通过与LC3和ATG12的相互作用被宿主细胞选择性地靶向清除[16]。其中所涉及的分子机制仍然知之甚少，但现已发现2种重要的异噬信号传导途径。

一种信号传导途径为结核分枝杆菌通过其VII型分泌系统ESX-1分泌的效应蛋白ESAT-6（early secreted antigenic target of 6 kDa）破坏宿主细胞吞噬泡进而诱导异噬。结核分枝杆菌从破溃的吞噬泡中逃逸至宿主细胞胞浆，激活STING/TBK-1/IRF3途径启动异噬，从而导致IFN-β分泌以及细菌蛋白质的泛素化[15]。泛素化过程涉及E3泛素连接酶Parkin，其在异噬过程中的泛素化底物尚不明确，但研究表明，Parkin通过Lys63多聚泛素蛋白链标记细菌后，泛素化的细菌与衔接蛋白p62（也称为SQSTM1），NDP52和异噬体修饰物LC3共定位并被递送至异噬通路，从而细菌被降解[15]。此外，Manzanillo[16]发现Parkin在体外和体内均能抑制结核分枝杆菌的繁殖，表明Parkin在泛素化结核分枝杆菌诱导的异噬过程中起重要作用。

另一种信号传导途径是结核分枝杆菌激活宿主细胞TLR/白细胞介素-1受体（IL1R）-MYD88-NF-κB先天免疫传感途径，在衔接蛋白p62以及细胞溶质内DNA传感器STING（stimulator of interferon genes）的协助下，促进DRAM1（DNA damage-regulated autophagy modulator 1）的表达，引发异噬。进一步研究发现，DRAM1的沉默会使巨噬细胞抵御结核分枝杆菌的能力降低，而其过度表达则会显著增强异噬作用从而导致感染降低[17]。

1.2  鼠伤寒沙门氏菌诱导的异噬机制  由图1可知，鼠伤寒沙门氏菌侵入肠上皮细胞后主要以2种方式存在[18]，一部分鼠伤寒沙门氏菌被沙门氏菌内含小泡SCV（Salmonella-containing vacuole）包被，另一部分鼠伤寒沙门氏菌会从破溃的SCV中逃逸出来游离于宿主细胞胞浆中，并以较快的速度繁殖，将其称为超级繁殖（hyper-replication）菌[19]。SCV包被的鼠伤寒沙门氏菌会在SCV中继续生长繁殖，直至一部分细菌通过其致病岛1 III型分泌系统（salmonella pathogenicity island 1 type III secretion system，SPI-1 T3SS）分泌效应蛋白对SCV膜打孔，破坏SCV膜的完整性，从而使沙门氏菌逃逸到胞质溶胶中[20]形成游离沙门氏菌，游离沙门氏菌与破溃的SCV膜均可引起宿主细胞异噬反应。

异噬过程中涉及到E3泛素连接酶LRSAM1识别细菌的富含亮氨酸重复序列（leucine rich repeat，LRR）并泛素化细菌，LRSAM1与沙门氏菌共定位，被泛素化的细菌招募衔接蛋白进入异噬流，从而减弱了宿主细胞胞质中游离鼠伤寒沙门氏菌的繁殖[21]。除LRSAM1外，线粒体自噬相关的E3泛素连接酶Parkin也参与了鼠伤寒沙门氏菌的异噬清除[22]，但其具体分子机制尚不清楚。

被泛素化的鼠傷寒沙门氏菌招募的衔接蛋白主要有3种。从图1可以看出，沙门氏菌入侵细胞后，细胞质中的细菌被泛素化蛋白修饰，这使得它们可以招募p62，然后p62通过与LC3的相互作用将细菌靶向异噬体[23]。第2种衔接蛋白Optineurin也具有抗沙门氏菌感染的作用，因其先天免疫受体TANK结合激酶1（TBK1）的磷酸化增加了LC3对沙门氏菌结合位点的亲和力，从而加强了细菌的消除[24]。参与异噬消除沙门氏菌的第3种衔接蛋白是NDP52（图1），NDP52在识别受损的SCV膜过程中起关键作用。一方面，NDP52能够检测细胞质中带有多聚泛素化蛋白的沙门氏菌，从而使细菌在泛素依赖性降解途径中被降解[25]。另一方面，在SCV膜破损后，存在于SCV膜内部的β-半乳糖苷暴露于胞质溶胶中，然后被胞质内半乳糖结合凝集素8（Galectin-8，GAL8）作为感受器感知并结合。GAL8随后结合NDP52，致使LC3修饰的异噬体募集破损的SCV并使其降解。值得注意的是，在该途径中，NDP52由GAL8募集，而不是由泛素化蛋白募集[26]。

1.3  福氏志贺氏菌诱导的异噬机制

福氏志贺氏菌入侵宿主细胞（上皮细胞和巨噬细胞）后不久，便可脱离吞噬泡，在宿主细胞胞质中进行复制[27]。在胞质溶胶中，福氏志贺氏菌募集肌动蛋白相关蛋白2/3（actin related protein 2/3，Arp2/3）复合物和N-WASP以诱导基于肌动蛋白的细胞间感染[28]，且该过程可被外膜转运蛋白IcsA所促进。

在感染细胞后，福氏志贺氏菌通过2种途径被宿主细胞异噬作用降解。一种为非泛素蛋白依赖性降解途径，在该途径中，ATG5通过识别IcsA，触发隔离膜的形成以包被细菌，而后ATG5与TECPR1结合，后者在与PI3P和WIPI-2相互作用下，促进细菌被招募至LC3修饰的异噬体内，进行异噬消灭[29]。Nagatake等[30]也发现在TECPR1缺陷的小鼠胚胎成纤维细胞中，福氏志贺氏菌诱导的选择性异噬存在缺陷，导致胞内福氏志贺氏菌大量繁殖，表明了TECPR1在异噬通路中的重要性。另一种为泛素蛋白依赖性降解途径，在该途径中，GTP结合蛋白Septins组装成非极性细丝、与肌动蛋白丝、微管和细胞膜结合[31]形成复合体，作为细胞骨架成分并被募集到由IcsA诱导的肌动蛋白聚合位点，形成笼状结构，从而捕捉胞质中的细菌，在泛素连接酶、衔接蛋白p62和NDP52的作用下，于LC3修饰的异噬体中将细菌降解[32-33]。另外，研究发现在斑马鱼中同样存在septin笼，表明其在进化上是一种保守的宿主防御成分[34]。

1.4  化脓性链球菌诱导的异噬机制

化脓性链球菌，也称为A族链球菌（GAS），研究发现，其侵入HeLa细胞后可在外毒素链球菌溶血素O（SLO）介导下从内体逃逸到细胞质中[35]，同时SLO也诱导异噬的发生[36]。Sakurai等[35]利用SLO基因缺失型GAS感染HeLa细胞后，发现宿主细胞内体中的GAS不会被募集到LC3修饰的异噬体中，从而不能被异噬消除，因此能比野生型菌株存活更长的时间，表明化脓性链球菌的SLO是诱导宿主细胞产生异噬作用的关键因素。

另一项研究表明，在GAS感染的人口腔角质形成细胞中，细菌通过其SLO和外毒素链球菌溶血素S（SLS）来破坏内体膜并逃逸到胞质溶胶中。内体膜结构被破坏后，逃逸的GAS在泛素化信号通路作用下被泛素化，进而招募衔接蛋白NDP52，p62和NBR1并结合，从而进入异噬流。此外，破溃的宿主细胞内体膜与GAL8结合后招募衔接蛋白NDP52，引发宿主细胞异噬反应。其中，SLO是与泛素结合所必需的，而SLS是与Galectin-8结合所必需的[37]。

研究表明，在异噬清除GAS过程中，RAB9A对于异噬体的形成和异噬体与溶酶体的融合是不可缺少的[38]，但迄今为止，尚未发现RAB9A参与传統自噬过程中自噬体的形成，突显了该蛋白在细胞内异噬清除病原体的独特作用。此外，在感染过程中，宿主细胞CD46受体也可通过激活Beclin-1与PI3K参与异噬的诱导和GAS的清除[39]。

2  小结与展望

在过去10多年中，已经证明了异噬作用在宿主细胞免疫病原体中的关键作用。目前，已有研究发现了识别不同微生物靶标的多种分子机制，如p62、NDP52和NBR1等衔接蛋白选择性识别不同病原体PAMP，这一过程是引发宿主细胞异噬反应进而清除病原体所必需的。此外，泛素连接酶（如Parkin和LRSAM-1）在宿主细胞异噬通路中起关键作用。研究发现，Parkin是宿主细胞线粒体自噬通路中的关键分子，且与帕金森综合征有关，而后又证明其参与宿主细胞异噬靶向清除结核分枝杆菌，表明宿主细胞异噬作用与线粒体自噬之间存在某种相关性。如今，对宿主细胞抗菌异噬级联反应分子机制的研究日渐深入，但该领域尚未解决的一个关键问题是宿主细胞如何感知细胞质中的细菌并用泛素标记它们以启动异噬级联反应。此外，不同病原体微生物在宿主细胞中被异噬作用清除的分子机制各不相同。因此，未来需要进一步研究免疫细胞中的异噬分子机制，以便充分了解这些复杂的、多层次的异噬防御机制。在异噬发生的同时，各种细菌也进化出了逃避异噬清除机制的方法，因此，充分研究不同微生物逃避异噬的分子机制是未来的另一目标。

抗菌药物耐药性的广泛出现已经引起人们对宿主定向疗法（host-directed therapies，HDT）的兴趣。充分了解不同的异噬过程和微生物免疫逃避机制，有利于针对病原微生物疾病的临床治疗。通过调节宿主免疫途径的特定位点，可以限制微生物在体内的感染。这些针对宿主免疫途径的药物可以在很大程度上避免细菌抗生素耐药性的发展。总之，这些宿主定向药物为抗菌治疗提供了新的研究思路。

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