固-液结合法合成布舍瑞林*

宋 芸，钟 霞，陈年根

(海南医学院，海南省热带药用植物研发重点实验室，海南 海口 571199)

布舍瑞林(Buserelin)是促性腺激素释放激素(LH-RH)激动剂类似物，为人工合成的线性九肽，其氨基酸序列为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(焦谷氨酸-组氨酸-色氨酸-丝氨酸-酪氨酸-(O-叔丁基)-D-丝氨酸-亮氨酸-精氨酸-脯氨酸-乙胺基)。化学结构式见图1。

图1 布舍瑞林的化学结构式

布舍瑞林剂型分为注射剂、鼻喷剂和植入剂三种，临床用于治疗前列腺癌、乳腺癌、子宫内膜异位症和子宫肌瘤等。目前，布舍瑞林原料药及其制剂均未进入中国。

布舍瑞林的合成方法主要包括固相合成、液相合成和固-液结合合成三种方法。固相合成方法中[1-4]，保护氨基酸和缩合试剂需要三倍过量或更多，氨基酸浪费较多，合成成本大。并且在最后的切肽工序中，6-位丝氨酸侧链叔丁基很容易在酸性条件下被脱除而生成其它杂质，反应收率较低。固相合成仅在最后一步进行纯化工序，粗品的纯度和肽含量均较低，给分离纯化带来很大的困难。

固-液结合合成布舍瑞林方法中，文献[5]用固相方法合成三肽片段H-D-Ser(But)-Leu-Arg(HCl)-OH，而另一种方法[6]合成七肽片段Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-OH，两种方法均使用TFA/DCM 体系进行多肽从树脂上切割。此多肽切割方法容易使6-位丝氨酸侧链叔丁基脱除，降低反应收率，后续分离纯化困难。

文献[7]报道了全液相5+4片段缩合合成布舍瑞林方法，氨基酸的氨基采用了Fmoc保护方式，其脱除采用25%哌啶/DMF 溶液。哌啶属于剧毒化学品，大量使用会造成严重的环境污染。

文献[8]采用4+3+2液相片段缩合法。而文献[9]采用(2+2)+(3+2)的液相片段合成策略。这两种方法均采用叠氮化合物法进行肽片段的缩合，叠氮物法操作危险，需要零下40 ℃以下低温，因此不适合产业化生产。

专利EP1008656[10]报道了另一种液相3+2+4合成布舍瑞林的方法，此方法的创新点在于使用了蛋白酶催化剂，但所得产物很难纯化。

本文目的是为了克服现有合成路线的缺陷，提供一种保护氨基酸和缩合剂来源丰富、反应条件温和、适合放大生产、收率高、纯化简便的布舍瑞林新合成方法，其合成路线如图2所示。

图2 布舍瑞林的合成路线

1 实 验

1.1 仪器与试剂

仪器：RP-HPLC型高效液相色谱仪，Waters公司；三重四极杆质谱仪，赛默飞世尔科技；Bruker ARX-400核磁共振波谱仪，瑞士Bruker；真空冷冻干燥机，北京博医康实验仪器有限公司。

试剂：pGlu、Fmoc-His(Trt)、Fmoc-Trp、Fmoc-Ser(But)、Fmoc-Tyr(Bzl)、Fmoc-D-Ser(But)、Fmoc-Leu、Fmoc-Arg(NO2)、Fmoc-Pro、2-Cl-Trt-树脂、N-甲基吗啉(DIEA)、1-羟基苯并三氮唑(HOBT)、苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)，上海吉尔生化有限公司；三氟乙酸(TFA)，Sigma公司；乙腈、二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、异丙醇和哌啶，北京百灵威化学试剂有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 Fmoc-Ser(But)-OH和Fmoc-Pro-OH分别与2-Cl-Trt树脂的连接

精确称取2-Cl-Trt树脂加入固相反应器中，并加入DMF浸泡30 min，而后依次加入Fmoc- Ser(But)-OH，苯并三氮唑-N,N,N’,N’-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)，N-羟基苯并三氮唑(HOBt)和4-二甲氨基哌啶(DMAP)，之后加入N-甲基吗啉(NMM)调pH=7～8，氮气吹拂，反应8 h。反应毕，将反应液抽干，然后用 DMF和二氯甲烷交替洗涤树脂，抽干。

Fmoc-Pro-OH与2-Cl-Trt树脂的连接采用上述相同的方法。

1.2.2 脱 Fmoc保护基

取体积分数为20%的 PIP(哌啶)/DMF溶液，加入Fmoc保护的氨基酸树脂中，缓慢搅拌40 min。脱除反应结束后，将反应液抽干，然后用DMF和DCM交替洗涤树脂至干净为止。

1.2.3 接肽反应

取3倍量的保护氨基酸，HBTU和HOBt，加入固相反应器中，加 DMF 溶剂和NMM调节pH=7～8，氮气吹拂，用Kaiser试剂监测反应进程。反应完成后，将反应液抽干，并用 DMF和DCM交替洗涤树脂。

1.2.4 四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH 的合成

根据四肽的氨基酸序列，三倍量的Fmoc-Trp-OH、Fmoc-His(Trt)-OH和pGlu依次按照接肽反应方法与Ser(But)-2-Cl-Trt树脂进行反应，得到全保护四肽树脂(pGlu-His(Trt)-Trp-Ser(But)-Resin)。洗涤干净后向固相反应器中加入比例为TFA:TIS:H2O=95:5.0:2.5的切割液反应30 min，抽滤，滤液旋蒸得粘稠状液体，倾入冰冷乙醚，有白色固体析出，固体经高压制备纯化得四肽纯品。

1.2.5 五肽Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-OH的合成

依据五肽的氨基酸序列，依次加入Fmoc-Arg(NO2)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Ser(But)-OH、Fmoc-Tyr(Bzl)-OH至Pro-2-Cl-Trt树脂体系进行接肽反应。接肽反应完毕后洗涤，再用TFA/DCM=1%的切割液切割树脂。旋蒸切割液，加入冷乙醚析出白色固体，收率为28.3%。

1.2.6 五肽Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成

称取Fmoc-5t 0.41 g(0.39 mmol)加入到25 mL圆底烧瓶中，加入DMF 10 mL，冰浴下加入DIEA，调pH约为8，向其中加入DCC(1.96 mmol)，HOBT(1.96 mmol)，搅拌溶解，反应 5 min。准确量取乙胺0.13 mL(2.0 mmol)加入反应体系中，室温搅拌，TLC监测反应进程，待Fmoc-5t消失后，将溶剂蒸除，加入乙醇，有白色固体析出，抽滤，真空干燥，收率为80.2%。

1.2.7 五肽Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt的合成

将Fmoc-Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 0.26 g(0.25 mmol)置于圆底烧瓶中，加入PIP:DMF=20% 的溶液10 mL搅拌溶解，TLC监测反应。得0.18 g白色固体，收率91.3%。

1.2.8 五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

向装有电磁搅拌的高压反应釜中加入Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt(4.8 g，5.0 mmol)，然后加入甲醇(100 mL)，搅拌至溶解，加入5% Pd/C(0.5 g)，氢气置换空气3次，于室温和10 bar的压力下反应2.0 h，反应毕。过滤，减压蒸除溶剂，用高压制备液相分离纯化后得纯品Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt(2.5 g，收率75.4%)。

1.2.9 布舍瑞林pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

取pGlu-His-Trp-Ser-OH 8.3 g(15 mmol)，溶于50 mL DMF中，冰盐浴下依次加入1.75 mL NMM，5.7 g HBTU和Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NH-Et 10.75 g(15 mmol)，补加NMM调节pH约为8，冰盐浴搅拌40 min后转至室温继续搅拌，高压液相色谱监测反应程度。反应毕，减压蒸除溶剂，残留物用甲醇-乙酸乙酯重结晶得白色固体粗品13.8 g。

1.2.10 布舍瑞林的高压制备液相分离纯化及冻干

用乙腈/水(20/80)溶液溶解粗品，浓度为1.0 g/mL，用TFA调整溶液pH值3.0左右。使用直径=300 mm、孔径=0.45 μm 微孔滤膜过滤待用。制备柱：15 cm×30 cm柱，kromasil 10 μm C18反相色谱填料颗粒。流动相A：0.1% TFA水溶液；流动相B：90%乙腈/10%水/0.1%TFA，梯度洗脱，收集主峰组份。旋转蒸除有机溶剂后，冻干得布舍瑞林纯品，纯度达98%。

2 结果与讨论

2.1 产物表征

采用上述合成路线所得布舍瑞林，质谱图中主峰显示的分子质量为1240.1 ku(M+H)+(图3)，与理论分子质量1038.66 ku基本吻合。经HPLC纯度分析，其纯度可达97%。主峰的保留时间与对照品完全一致，结合质谱结果，说明产物为布舍瑞林。

图3 布舍瑞林的质谱结果

图4 布舍瑞林的HPLC色谱图

HPLC的色谱条件：4.6 mm×25 cm(C18)；流动相A液：1 mL/L三氟乙酸/水溶液，B液：1 mL/L三氟乙酸/乙腈溶液。梯度洗脱：900 mL/L A液+100 mL/L B液在35 min内降为100 mL/L A液+ 900 mL/L B液，检测波长：220 nm，流速：1 mL/min。

2.2 四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH的固相合成

2.2.1 采用Fmoc-Trp-OH代替Fmoc-Trp(Boc)-OH可降低成本

表1 Fmoc-Trp-OH代替Fmoc-Trp(Boc)-OH的影响

比较了Fmoc-Trp(Boc)-OH和Fmoc-Trp-OH对四肽合成的影响，结果如表1所示。使用Fmoc-Trp-OH进行四肽合成，对粗品纯度和收率的影响不大，但Fmoc-Trp-OH的分子量更小且价格更为便宜，因此可大大降低四肽的合成成本。

2.2.2 切割剂的选择

当使用酸将肽链从树脂上切除时，会产生碳正离子树脂，同时一些侧链保护基也会被酸解下来，产生侧链保护基的碳正离子，如果这些碳正离子没有及时被清除，就会被肽链中亲核性强的基团进攻，形成副产物，因此，应该加入清除剂将碳正离子捕获。本实验对两种清除剂乙二硫醇(EDT)和三异丙基硅烷(TIS)作用效果进行了比较，结果见表2。

表2 切割试剂的选择

将乙醚吹干后，以EDT为清除剂的产品，性状为粘稠状，高压制备液相后产率为28.3%，以TIS为清除剂的产品，得到白色固体，经高压制备液相后产率为29.6%，两者产率相差不大，但是由于EDT本身有恶臭的气味，产物粘稠，因此最终选用TIS作为清除剂。

2.3 五肽Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt的合成

2.3.1 树脂的选择

五肽的C末端氨基酸为Pro，其很容易产生哌嗪二酮，导致肽的产量降低。由于2-Cl-Trt树脂2位Cl原子的空间位阻比较大，使其形成哌嗪二酮的几率降低，因此本实验采用2-Cl-Trt树脂为固相载体。

2.3.2 4+5片段缩合合成布舍瑞林

本文考察了两种4+5片段缩合合成布舍瑞林的方法。方法1：四肽pGlu-His-Trp-Ser-OH与保护五肽Tyr(Bzl)-D-Ser(But)-Leu-Arg(NO2)-Pro-NHEt 在缩合剂作用下先生成保护九肽，再催化氢化脱除侧链保护基得布舍瑞林；方法2：先脱除五肽的侧链保护基得Tyr-D-Ser(But)-Leu-Arg-Pro-NHEt，然后与四肽反应得到布舍瑞林。实验发现，采用方法1反应时间更长，收率低且产物复杂，很难纯化。因此选择方法2进行布舍瑞林的合成。

3 结 论

通过液相-固相结合的方法合成布舍瑞林，既简化了纯液相合成的繁琐，缩短了反应时间，又避免了纯固相合成中间过程难以控制，副产物多难以纯化的缺点。