维生素D及其受体与肾盂输尿管连接部狭窄相关性的初步研究

邢晓宇 陈思平 钟 量 吴少峰 孙 杰

活性维生素D一直被认为是体内钙磷代谢的重要调节因子，近年研究发现，活性维生素D与特定的维生素D受体(vitamin D receptor,VDR)结合后可以影响基因转录、调节靶蛋白合成、诱导细胞分化[1]。研究表明，肾盂输尿管连接部狭窄(ureteropelvic junction obstruction，UPJO)的发生发展和肾盂输尿管连接部(ureteropelvic junction，UPJ)组织纤维化加重息息相关，而体内纤维化活动又与活性维生素D及受体密切相关，维生素D能抑制转化生长因子(transforming growth factor-β，TGF-β)的表达，也可延缓或阻止上皮细胞向成纤维细胞分化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)[2-4]。本实验通过研究维生素D及其受体与UPJO的相关性，初步探讨UPJO发生发展机制，为UPJO的预防及诊治提供新的思路和途径。

材料与方法

一、 一般资料

收集2016年3月1日至2016年10月31日上海儿童医学中心因UPJO行开放或腹腔镜下离断式肾盂输尿管成形术的10例患儿作为UPJO组，年龄2个月至10岁，其中男7例，女3例。患儿均为单侧肾积水，其中左肾积水9例，右肾积水1例。纳入标准:术前B超、CT、MRI、ECT等辅助检查中的一项或多项结果提示UPJO阳性，且术后病理明确肾盂输尿管连接部狭窄的肾积水患儿入UPJO组。排除标准：下尿路梗阻、异位血管压迫输尿管肾盂交界处、重复肾等原因引起肾积水的患儿(本组术中亦发现1例因肾下极动脉分支压迫致肾积水的患儿，将其剔除)。

收集同期因肾脏肿瘤行肾盂输尿管切除术的8例患儿作为对照组，年龄1～5岁，其中男5例，女3例，左肾肿瘤6例。纳入标准：术前影像学检查及术后病理明确为肾母细胞瘤Ⅰ～Ⅱ级患儿，如术中发现输尿管近端明显肿瘤浸润或梗阻则排除。

二、标本采集

在获得本单位伦理审批的基础上，入组的18例患儿术前均留取外周静脉血，血标本均在当天送检。18例均于术中留取UPJ标本，UPJ标本离体后均在2 h内留取本研究所需部分(标本留取时要求近端至部分肾盂组织，远端至UPJ远端约1 cm)。UPJO组所取标本均完整(包括明显狭窄段)。标本收集后存放于-80℃冰箱，标本收集完成后采用酶联免疫吸附(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法测定25-羟维生素D2、25-羟维生素D3、总25-羟维生素D、VDR、TGF-β以及钙黏蛋白E含量。

三、检测方法

术前外周静脉血标本采用双抗夹心法检测维生素D三项(即25-羟维生素D2、25-羟维生素D3及总25-羟维生素D)的含量。具体步骤如下：于酶标板上包被维生素D单抗，将标本和标准品中的维生素D与单抗结合后，洗去游离成分，再加入酶标抗体形成免疫复合物。然后加入显色底物，若反应孔中有维生素D，则辣根过氧化物酶会使无色的显色剂显蓝色，加入终止液后混合液变黄。在450 nm处测OD值，维生素D浓度与OD450值之间成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中的维生素D浓度。

术中收集的18例UPJ标本，同样采用双抗夹心法，在450 nm处检测VDR、TGF-β及钙黏蛋白E的含量。所有项目由同一检测员完成，各检测项目均复查2遍以尽量减少误差。

四、统计学处理

结 果

UPJO组25-羟维生素D2的平均值为(2.185±1.221)ng/mL，25-羟维生素D3的平均值为(28.364±6.650)ng/mL，总25-羟维生素D的平均值为(30.549±6.908)ng/mL；8例肿瘤对照组患儿25-羟维生素D2平均值为(2.926±1.863)ng/mL，25-羟维生素D3的平均值为(33.745±10.523)ng/mL，总25-羟维生素D的平均值为(36.675±10.507)ng/mL，上述指标差异均无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 两组术前血标本中维生素D值(ng/mL)Table 1 Preoperative value of vitamin D in two groups(ng/mL)组别例数25-羟维生素D225-羟维生素D3总25-羟维生素D UPJO组102.185±1.22128.364±6.65030.549±6.908对照组82.926±1.86333.745±10.52336.675±10.507t值1.0181.3261.490P值0.3240.2040.156

UPJO组VDR平均值为(771.60±70.57)ng/每克总蛋白；对照组VDR平均值为(2 128.00±251.80)ng/每克总蛋白，两组间比较差异有统计学意义(t=5.720，P<0.001)。UPJO组TGF-β平均值为(131.00±10.33)ng/每克总蛋白；对照组VDR平均值为(82.30±6.83)ng/每克总蛋白；两组间比较差异有统计学意义(t=3.714，P=0.019)，UPJO组钙黏蛋白E平均值为(125.50±10.98)ng/每克总蛋白；对照组VDR平均值为(386.60±78.71)ng/每克总蛋白；两组间比较差异有统计学意义(t=3.684，P=0.020)，见表2。

表2 两组UPJ标本中VDR、TGF-β、钙粘蛋白E值(ng/每克总蛋白)Table 2 Values of VDR,TGF-β and cadherin E(ng/g,x+s)组别例数VDRTGF-β钙黏蛋白EUPJO组10771.60±70.57131.00±10.33125.50±10.98对照组82128.00±251.8082.30±6.83386.60±78.71t值 5.7203.7143.684P值<0.0010.0190.020

讨 论

UPJO是婴幼儿期肾积水常见原因之一，是一种先天性的泌尿系统发育畸形[5]。引起UPJO的原因包括UPJ狭窄、瓣膜、高位输尿管以及异位血管压迫等，其中UPJ狭窄大多起源于胚胎时期泌尿系统原基发育缺陷。不同原因引起的UPJO病理改变相似，均与肾盂输尿管连接段纤维化加重有关，多表现为纤维组织增生、肌层发育不良等[2,6,7]。目前有研究发现先天性肾盂输尿管连接部梗阻段输尿管平滑肌出现病理性改变是导致UPJO的直接原因，但其具体机制尚不清楚。研究UPJO的发病机制将对UPJO的诊断、治疗及预后评估起重要作用。

本研究发现UPJO组和对照组外周血中维生素含量无明显差异，UPJO组的VDR、钙黏蛋白E表达量显著低于对照组，而TGF-β则显著高于对照组。其中钙黏蛋白E是上皮细胞的标记物，代表了组织的上皮化程度。我们推测VDR参与纤维化机制表现为：组织中VDR含量下降，引起TGF-β表达上升，继而诱发细胞的ETM过程，最终导致组织纤维化加重，从而引起UPJO的发生、发展。

维生素D是人体所需的重要维生素之一，可通过皮肤紫外线照射或食物等外源性途径补充获得。维生素D经过肝脏和肾脏中羟化酶作用下，转变为有活性的维生素D(即1,25-羟维生素D，亦称活性维生素D)。活性维生素D与组织细胞内的VDR结合，发挥着重要的生物学效应[8]。有报道维生素D在系统性硬化病的发生发展中起关键作用，该研究发现系统性硬化症患者中维生素D3含量下降，同时成纤维细胞中VDR的表达量下降，引起TGF-β表达量升高，从而导致硬化症的发生[3]。TGF-β是一类具有广泛生物学作用的细胞因子，参与调节组织内间质纤维化的过程[9]。TGF-β促进成纤维细胞转分化、促进成纤维细胞合成和分泌胶原蛋白等细胞外基质(extracellular matrix,ECM)、抑制ECM降解、抑制上皮细胞生长等。此外，TGF-β还可通过SMAD途径诱导正常上皮细胞逐步丧失钙黏蛋白E，提高肌成纤维细胞标志物α-SMA的水平，进而使肌成纤维细胞分泌大量ECM，这些证据都被认为是TGF-β通路促进纤维化的机制。既往研究发现，在UPJ纤维化的过程中，TGF-β起到了最重要的作用[10]。有研究者在单侧输尿管梗阻大鼠模型中发现，活性维生素D及其受体可显著抑制患肾炎大鼠肾组织中TGF-β以及Ⅰ型和Ⅳ型胶原的表达，从而达到治疗目的[11]。Tian等[12]在糖尿病肾病模型大鼠中发现，外源性补充维生素D后可减少胶原沉积、减少纤维连接蛋白含量和胶原mRNA的表达，抑制TGF-β及其Ⅰ型受体的表达，从而直接阻断EMT的过程，显著减轻肾间质纤维化，达到保护模型大鼠肾脏功能的目的。本研究发现，UPJO组患儿VDR含量较对照组低，TGF-β较对照组增高，推测其原因可能是UPJO组患儿VDR缺少对TGF-β的抑制作用，阻断EMT过程能力减弱，从而引起UPJ标本处的纤维化，但两者间相互关系仍需要进一步研究。

在人体内有两种形式的维生素D，分别是维生素D3(胆钙化醇)和维生素D2(麦角钙化醇)。本研究发现UPJO组和对照组患儿25-羟维生素D2、25-羟维生素D3及体内25-羟维生素D的总含量无统计学差异，这表明单纯通过维生素D的血清学定量分析结果无法得出维生素D与UPJO之间的关系。同时本实验发现，UPJO组患儿血清总25-羟维生素D水平为(30.54±6.91)ng/mL，对照组患儿总25-羟维生素D均值(36.68±10.50)ng/mL，两组患儿总25-羟维生素D水平普遍在正常值下限甚至处于维生素D不足的状态。

综上，尽管UPJO组血维生素D含量无差异，但病变段平滑肌VDR缺乏可能抑制TGF-β的表达，使病变段组织纤维化加重，进而导致或加重UPJO。尽管本实验基本达到了预期的研究目的，但仍存在诸多的局限性。首先，标本来源于单中心，样本量较小；此外，本研究没有对肾盂输尿管连接部的直径以及病变段中TGF-β水平进行分级。因此，还需要更多深入的研究来全面阐明纤维化程度是否与TGF-β含量存在关联，从而为临床治疗和预防UPJO提供良好的理论参考依据。