液相色谱塔板高度方程的统一形式

2020-03-31戴朝政徐小平

色谱 2020年5期

戴朝政, 徐小平

(1. 中国科学院成都有机化学研究所, 四川成都 610041; 2. 四川大学华西药学院, 四川成都 610041)

色谱过程动力学研究通常是把色谱柱简化为一维空间看待,只考虑各种纵向扩散因素对分离效能的影响。实际上,物质在柱内的扩散是在三维空间中进行的。组分的径向扩散改变了分子在柱内行进的路线与距离,最终造成谱带弥散。此外,液相色谱动力学过程研究一般也没有考虑色谱分析过程中流动相发热对柱效能的影响。但是随着色谱技术的发展,吸附剂粒径越来越小,因而所需要的色谱柱前压力越来越高,柱压的升高使流动相通过担体摩擦生热,导致柱温升高。当前采用的UPLC的柱前压可达100～150 MPa,在这样高的压力下，1 mL流动相通过色谱柱因摩擦生热可达100～150 J。而毛细管电色谱(CEC)以及消滞留层色谱(eliminate stagnant fluid layer chromatography, ESFLC)都要在色谱柱两端施加电压,电流通过流动相也会发热导致柱温升高,发热现象更加明显。由于柱边缘与外界接触可以散热,因此柱中心的温度比柱断面边缘要高,可形成一个环形与中心对称的温度梯度。柱中心流动相温度高、黏度低,故流速快,柱断面边缘流动相流速慢。断面上流速的差异使得柱内传输的物质先后到达检测系统,形成纵向弥散。

20世纪70年代,Horvath和Lin[1,2]运用间隙滞流体模型导出了液相色谱塔板高度方程(公式符号意义和推导过程请见参考文献[3]):

(1)

公式1没有考虑在色谱过程中物质的径向扩散和流动相发热升温对塔板高度的影响。但随着色谱技术的发展,必须要考虑柱发热与升温以及物质的径向扩散与塔板高度的关系。在此,笔者从热传导方程出发,推导了包含径向扩散和流动相发热升温因素在内的液相色谱塔板高度公式。该公式既可描述传统的HPLC也可以概括UPLC、CEC、ESFLC塔板高度方程，为液相色谱技术进一步发展提供指导意见。

1 基础知识

理论上UPLC、CEC、ESFLC与HPLC除流动相驱动力的大小和方式不同,色谱过程并无实质性差别,上述色谱过程柱发热原理虽然有所不同,也只是热源密度函数的表述不同。因此塔板高度统一公式需在公式1的基础上补充流动相在柱内温度分布场和径向扩散对柱效率的影响。

径向扩散与流动相流型有关,流动相流型又与柱内温度分布场有关。如果径向扩散对塔板高度的贡献为H径,塔板高度公式应是在公式1的基础上加上H径项,而H径项中概括了流动相流型和温度分布场的贡献。根据色谱过程动力学理论,H径与相应的径向扩散系数D径关系为[3]:

(2)

其中,D径为因径向扩散和温度场的存在形成谱带弥散的扩散系数,ν为谱带在柱内移动的速度。

2 理论推导

径向扩散是在流动相中进行的,因此与流动相流型有关。流动相流型又与柱内的温度分布有关。因此首先要考虑色谱过程进行时，柱内温度是如何分布的。

2.1 均匀发热无限长度圆柱体内温度场的平衡分布

通过经典的热传导方程[4],可解得在均匀内热源情况下，温度(T)沿柱截面径向分布函数为：

(3)

式中,r0为柱内半径,r为离轴心的距离;T0为柱内壁的平衡温度;K为与热强度、热传导系数有关的常数。对于液体溶剂摩擦生热有：

(4)

(5)

K与电场强度E平方成正比,与流动相的热导效率λc、摩尔电导率λi、摩尔浓度ci,以及流动相在柱断面占有分数κ1有关(由于担体内部的流动相可导电,此处流动相在柱断面占有分数κ1与通常理解的流动相在柱断面占有分数κ1数值上略微不同)。

2.2 温度场对谱带弥散的影响

温度的差异可以导致流动相黏度产生变化，从而引起流动相流速径向分布产生差异。在温度差不太大的情况下,Knox[5]指出,液体的黏度与温度的关系为:

η=η0exp(α×ΔT)

(6)

其中,η0为流动相的温度为T0时的黏度;α为流动相黏度的温度系数。由于流动相线速度与黏度成反比,考虑到公式3,色谱柱内流动相线速度的径向分布函数为:

(7)

×exp(Kr2α)=Aexp(Kr2α)

(8)

其中常数(A)为:

(9)

2.3 径向弥散系数D径对塔板高度的贡献

|Kr2α|远小于1,因此有如下公式:

u(r)-ν(r)≈A(1+Kr2α)

(10)

以下把上式中u(r)和ν(r)简写为u和ν,则有如下公式[6]:

(11)

(12)

(13)

进一步解得到:

(14)

(15)

(16)

最后得到考虑到径向扩散和热效应的液相色谱塔板高度统一公式:

(17)

3 结果与讨论

图1 (a)塔板高度与流动相线速度的关系和(b)Horvath和Lin曲线Fig. 1 Relationship of plate height (H) and the linear velocity of mobile phase (u)and (b) Horvath and Lin’s curve

从公式17最后一项可以看出,径向扩散项与柱内径r0密切相关,在高流动相线速度的情况下,采用细粒径的担体与细内径的色谱柱相配才会实现高效。这也就是随着时代的发展,分析型色谱柱内径越来越细的原因。

(18)

图2 毛细管内半径为(a)50 μm和(b)160 μm时流动性线速度与塔板高度的关系[10]Fig. 2 Relationship between u and H with radius of (a) 50 μm and (b) 160 μm[10]

毛细管电色谱在柱两端施加了较高电压,电场强度E值较高,往往可达1 000 V/cm,因此K值较大,流动相在柱内发热严重,导致毛细管电色谱只能使用内径较细的色谱柱才能实现高效。研究人员对电色谱塔板高度方程进行了考察(见图2)[10]。实验采用P/ACE5010电泳仪和Trisep-2000GV毛细管三用电泳仪,流动相5 mmol/L磷酸水溶液(pH 9)-乙腈(20∶80, v/v),恒温箱温度20 ℃,自制整体柱[11,12]柱长30 cm,填充长度21 cm,紫外检测波长214 nm。实验采用50 μm与160 μm内径的色谱柱进行比较,在相同条件下,发现柱效与毛细管内径密切相关。柱内径增大热效应明显增加,导致柱效急剧下降,结论与理论相符。

以绿原酸为试样,色谱柱采用ODS带金属螺帽塑料柱(35 mm×3.5 mm, 5 μm),以0.3%(v/v)甲醇水溶液-乙腈(92∶8, v/v)为流动相,施加不同消滞留层电场强度时柱塔板高度见图3。当电场强度E=0时,相当于HPLC由于存在吸附剂颗粒表面滞留层对传质的影响,塔板数较低,总塔板数为1 552(塔板高度23 μm)。在柱两端施加消滞留层电压后,由于担体表面电渗流的形成,滞留层消失,公式17中滞留层项的贡献也随之消失。当E<10 V/cm时,柱温提高不很明显,可以看到消滞留层的效果,最高塔板数达到1 795(塔板高度19.5 μm)。继续升高消滞留电场强度(E>25 V/cm),电场的热效应对塔板高度的影响则有所体现,柱效开始下降。继续升高电压塔板高度非线性急剧上升。因此,进一步提高电压会使柱效降低,以至柱效率崩溃。

图3 消滞留层电场强度与塔板高度的关系Fig. 3 Relationships of eliminate stagnant fluid layer electric field strength and plate height

图4是分析同一样品时色谱柱施加消滞留层电压与不施加消滞留层电压的电谱图。可以看出,施加消滞留层的电压后，目标物峰形变狭窄,柱效增加。

图4 施加消滞留层电压后峰形宽度的变化Fig. 4 Variation of peak shape width after application of residual layer voltageSample: combretastatin A4 phosphate (CA4P).

4 结论

填充柱色谱过程动力学研究了几十年,但研究工作者往往把色谱柱作为一维空间考虑,注意力集中在物质输运过程中纵向扩散对柱效率的影响,而没有认识到物质在柱内径向扩散对塔板高度的贡献。实际上在色谱过程中,物质的输运是在三维空间进行的。组分在柱内的输运过程中,不但会在纵向(z轴)扩散,而且会沿径向(x、y轴)扩散。径向扩散使得不同的分子有不同的行进路线。此外由于温度场的影响,流动相线速度在柱断面分布的差异,最终导致色谱峰形的扩张。

本文从热传导方程出发，在Horvath和Lin公式的基础上推导了包含径向扩散因素及温度场在内的液相色谱塔板高度统一方程。此方程概括了HPLC、UPLC、CEC、ESFLC色谱过程动力学中各种因素对塔板高度的影响。从上述公式可见,色谱过程中发生的径向扩散和色谱柱的发热也是影响色谱分离效能的重要因素。液相色谱的H/u曲线并非过去认为的V型线而是U型线;过高的流动相线速度将导致柱效率崩溃;尤其是高流速、高压情况下柱效与柱内径密切相关。