左归丸对围绝经期抑郁症模型小鼠行为学影响及神经保护机制研究

王 睿 吴睦霖 王 伟 邢宇双 常金龙

现代医学认为，围绝经期抑郁症是一种常见的由生物、社会及心理等共同作用的心境障碍性疾病，与遗传、神经内分泌功能失调、社会心理应激、神经可塑性障碍等因素有关[1]。其中社会心理应激+低雌激素水平被认为是围绝经期抑郁症主要致病原因。古代中医认为，围绝经期抑郁症为“情感失调、病位在脑、肾脑失济”所致，其本质为“肾阴亏虚、肝火亢盛、扰动心神”，即肾精不足影响脑的形态与功能，“肾精亏虚-肾脑失济”是致病之本和主要病机[2]。

对于围绝经期抑郁症治疗，西医临床多基于抑郁症“单胺类神经递质缺乏”学说，采用单用抗抑郁药物，即三环及四环类抗抑郁药(米帕明、氯米帕明、阿米替丁等)、选择性5-HT再摄取抑制剂(氟西汀、帕罗西汀、舍曲林等)及单胺氧化酶抑制剂(异烟肼、氯丙胺等)，单用激素替代疗法(hormone replacement therapy，HRT)和激素+抗抑郁药物治疗。但因抗抑郁西药“临床效应时间滞后”现象、不良反应大及成瘾性，孕激素耗竭维生素B6，雌激素(estrogen，E)致癌性(乳腺癌、子宫内膜癌)使其纷争不断。

“补肾健脑”是中医临床治疗脑病特色疗法。中药以效应广泛、毒性不良反应小、协同作用强特点，在围绝经期抑郁症这种病因不清、致病危险因素多、发病机制复杂的情志疾病中具有独特优势。中药可通过“众多显效形式的单靶点叠加作用、多靶点协同作用及毒性分散效应”发挥药效并削弱自身毒性[3]。

左归丸出自《景岳全书·新八方阵》，为明代医家张景岳“滋阴补肾，益精填髓”代表名方，主要由熟地、山药、枸杞、山茱萸、川牛膝、菟丝子、鹿角胶、龟板胶八味药物组成，用于肾阴虚所致诸多症状[4]。现代医学研究表明，左归丸具有神经保护作用及植物雌激素活性，对脑损伤具有神经保护作用，可缓解肾阴虚所致更年期综合征等妇科疾病，可调节患者肾阴亏虚、肝血不足及情志失调引起的阴阳失衡[5～7]。本研究以围绝经期抑郁症小鼠模型为研究对象，探讨左归丸抗围绝经期抑郁症的神经保护作用及机制，为临床抗抑郁症药物研发提供新的方向。

材料与方法

1.材料：药品与试剂：左归丸(上海雷允上封浜制药有限公司，批号151012)，盐酸氟西汀胶囊(Fluoxetine，FLU，苏州礼来制药，批号2076AC)，戊酸雌二醇(拜耳医药有限公司，批号258A2)，全蛋白提取试剂盒(碧云天生物技术，批号062916160817)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术，批号032516160711)，小鼠E2、5-HT、NE、DA 试剂盒购自北京诚林生物技术有限公司，批号分别为20180601、20170204、20170201、20170106，CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB、β-Actin、山羊抗兔IgG/HRP多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术公司，批号分别为999802W、99983F、14D526、9H124、AF11026274、AF12114126，其他试剂均为国产分析纯试剂。

2.主要仪器：旷场反应箱(上海移数信息科技有限公司)，小鼠悬尾装置(自制)，TECAN酶标仪(上海闪谱生物科技有限公司)。

3.实验动物：清洁级雌性昆明小鼠，体质量20±2g，购自齐齐哈尔医学院实验动物中心，生产许可证号为SCXK(黑)2016-001。

4.动物模型制备、分组及给药：OFT筛选评分相近小鼠60只，适应性饲养1周。根据SPSS 19.0统计学软件产生随机数字分为6组，即假手术组、围绝经期抑郁症模型组、氟西汀+雌激素组(FLU+E2组，3mg/kg+0.15mg/kg)、左归丸低、中、高剂量组(11.5mg/kg、23.0mg/kg、46.0mg/kg)，每组10只。小鼠饲养条件、围绝经期抑郁症模型制备方法、卵巢切除术前及术后饲养方法、CUMS刺激方式参照文献[8]。

5.旷场实验(open filed test，OFT)：OFT可以检测大、小鼠在新奇环境中的自主活动(水平运动得分)、探索活动(垂直运动得分)及紧张恐惧程度(粪便例数)[8]。悬尾实验(tail suspension test，TST)：TST最早由法国药理学家Luscien Steru等根据“搜索-等待策略”原理建立，可用于评价和筛选抗抑郁药物[9]。以上两组实验在应激第1天、第21天(9:00～11：00时)各测定1次，平行实验并对测试者设盲，避免“希望效应”。

6.血清E2含量测定：行为学测试结束后，小鼠摘眼球，取血，4℃匀浆，2300r/min离心10min，静止，吸取上清，-80℃保存。按照ELISA法试剂盒说明书进行操作，测定血清E2含量。脑组织单胺类神经递质含量测定：行为学测试结束后取脑组织，ELISA法测定脑组织单胺类神经递质5-HT、DA及NE含量[10]。

7.海马组织CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB蛋白含量测定：采用Western blot法检测蛋白表达。行为学测试结束后取脑海马组织，投入液氮中研磨，经蛋白抽提→定量→上样(每孔上样量20μg)→电泳(电压100V、15min，进入分离胶后，电压120V，90min)→湿法转膜(100V，90min)→5%脱脂奶粉封闭→兔源一抗(CREB-1、p-CREB-1、BDNF、TrkB及β-actin抗体稀释浓度分别为1∶800、1∶800、1∶800、1∶800及1∶1000)孵育(4℃、过夜)→山羊抗兔IgG/HRP(1∶2000)孵育(室温，120min)→ECL显色。采用目的条带/内参条带吸光度作为结果进行统计分析。

结 果

1.左归丸可改善围绝经期抑郁症模型小鼠抑郁样行为：(1)OFT：应激第1天，各实验组小鼠水平运动及垂直运动得分比较差异无统计学意义(P>0.05)。应激第21天，与假手术组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠OFT水平运动及垂直运动得分减少；与围绝经期抑郁症模型组比较，给予FLU+E2、左归丸各剂量组治疗后，可增加OFT水平运动及垂直运动得分；左归丸各剂量组组间比较，以中剂量组较为明显；差异有统计学意义(P<0.05，表1)。(2)TST：应激第1天，各实验组小鼠悬尾不动时间比较差异无统计学意义(P>0.05)。应激第21天，与假手术组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠悬尾不动时间增加；与围绝经期抑郁症模型组比较，给予FLU+E2、左归丸各剂量组治疗后，小鼠悬尾不动时间减少；左归丸各剂量组组间比较，以中剂量组较为明显，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。

表1 左归丸对围绝经期抑郁症模型小鼠行为学影响

与假手术组比较，*P<0.01；与围绝经期抑郁症模型组比较，#P<0.01；与左归丸各剂量组比较，△P<0.05

2.左归丸可增加围绝经期抑郁症模型小鼠血清E2含量：与假手术组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠血清E2含量减少；与围绝经期抑郁症模型组小鼠比较，给予FLU+E2、左归丸各剂量组治疗后，小鼠血清E2含量增加；左归丸各剂量组组间比较，以中剂量较为明显，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 左归丸对围绝经期抑郁症模型小鼠单胺类神经递质、E2含量影响

与假手术组比较，*P<0.01；与围绝经期抑郁症模型组比较，#P<0.01；与左归丸各剂量组比较，△P<0.05

3.左归丸可增加围绝经期抑郁症模型小鼠脑组织单胺类神经递质含量：与假手术组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠脑组织5-HT、NE、DA含量减少；与围绝经期抑郁症模型组小鼠比较，给予药物治疗后，脑组织5-HT、NE、DA含量增加；左归丸各剂量组组间比较，以中剂量较为明显，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

4.左归丸可上调小鼠海马组织CREB/BDNF信号通路主要蛋白表达：与假手术组比较，围绝经期抑郁症模型组小鼠海马组织CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表达减少；与围绝经期抑郁症模型组比较，给予各药物治疗后，可上调海马组织CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表达；左归丸各剂量组组间比较，以中剂量较为明显；差异有统计学意义(P<0.05，表3，图1)。

表3 左归丸对围绝经期抑郁症模型小鼠海马组织主要蛋白表达影响

与假手术组比较，*P<0.01；与围绝经期抑郁症模型组比较，#P<0.01；与左归丸各剂量组比较，△P<0.05

图1 左归丸对各组小鼠海马组织CREB/BDNF信号通路主要蛋白表达影响A.假手术组；B.围绝经期抑郁症模型组；C.FLU+E2组；D.左归丸低剂量组；E.左归丸中剂量组；F.左归丸高剂量组

讨 论

围绝经期女性因社会心理应激敏感度增加，体内雌激素水平下调致使抑郁症高发。抗抑郁西药+HRT为临床治疗围绝经期抑郁症主要方法，但因药物诸多不良反应面临瓶颈。因此，从祖国医学中寻求高效、低毒、具有神经保护及抗抑郁作用中药制剂具有重要的现实意义。

本研究中笔者基于中医“肾脑相关”理论，采用FLU+E2作为阳性对照药物，采用OVX+CUMS法建立围绝经期抑郁症小鼠模型，通过4个方面评价左归丸对围绝经期抑郁症模型小鼠行为学影响及神经生物学机制[11]。

在围绝经期抑郁症模型制备中，笔者采用小鼠双侧OVX方式模拟围绝经期“雌激素撤退”病因学说，采用CUMS方式模拟外界环境刺激，经预实验测试，结果显示，围绝经期抑郁症模型组小鼠表现抑郁样行为，使用左归丸治疗后，可改善各组小鼠抑郁样行为。笔者不但验证了复合模型能够较大程度模拟围绝经期抑郁症相似病因，说明模型制备是成功的；也证实了选用具有“滋阴补肾、填精益髓”、兼备植物雌激素活性的左归丸具有拮抗抑郁症作用，笔者的研究进一步拓宽了左归丸的药用价值。

在阐明抑郁症发病机制研究中，“单胺类神经递质缺乏”学说具有里程碑性质的意义。单胺类神经递质主要包括5-HT、DA及NE，其代谢产物对神经、内分泌及心血管系统具有重要的调节作用，并对情感、情绪及行为活动产生影响。临床上抗抑郁症药物研发多基于此学说，通过多种途径靶向增加突触间隙单胺类神经递质含量达到抗抑郁症效果。基于此，笔者探讨左归丸对脑单胺类神经递质影响，结果发现，左归丸可上调围绝经期抑郁症模型小鼠脑组织单胺类神经递质含量。

“雌激素水平下降”是围绝经期抑郁症患者独有特征。雌激素为“天然的神经营养因子”，可透过血脑屏障并在脑内、外合成，可调节女性生殖功能、脑发育、突触可塑性、学习记忆及认知功能，可通过抗炎、抗氧化应激、抑制神经元凋亡、调控脑单胺类神经递质及受体信号通路、促进神经营养因子表达、通过γ-氨基丁酸(GABA)途径调节HPA轴具有神经保护作用。基于此，笔者发现，左归丸可增加围绝经期抑郁症模型小鼠血清E2含量。

“海马神经可塑性障碍”是近年来抑郁症病因学最具突破性理论。该学说认为，抑郁症发生与海马神经可塑性失调密切相关[12]。神经可塑性即脑可塑性，指中枢神经系统在结构和功能上的可修饰性，具体表现为神经元、神经胶质细胞损伤变化与神经元内信号转导通路发生障碍，主要包括神经再生(树突延伸、树突棘密度变化、轴突生长、轴突发芽、突触再生等)、突触可塑性调节(长时称增强、长时程抑制)等。CREB/BDNF信号通路被认为是海马神经可塑性调节关键信号因子，该信号通路相关蛋白表达与抑郁症发生、发展关系密切，为各种信号蛋白信息转导交汇点[13]。基于此，笔者采用Westeron blot法检测各组小鼠海马组织CREB/BDNF信号通路主要蛋白表达。结果发现，左归丸可上调该信号通路CREB-1、p-CREB-1、BDNF及TrkB蛋白表达。

综上所述，左归丸对围绝经期抑郁症模型小鼠抑郁样行为具有拮抗作用，其中以中剂量最为显著。左归丸脑保护作用的神经生物学机制与上调单胺类神经递质5-HT、NE、DA含量、上调血清E2含量、上调CREB-BDNF/TrkB信号通路主要蛋白表达有关。