线粒体调控NLRP3炎性复合体活化的机制及中药有效成分干预作用

南凤尾 景光婵 张孟仁

固有免疫应答是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线，能够启动和参与适应性免疫应答。固有免疫细胞表面存在模式识别受体(pattern recognition receptors, PRRs)，PRRs感受到病原体入侵或内源性损伤时，可与病原微生物表面的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)或内源性损伤来源的损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)发生相对特异性的结合，启动即时免疫效应。核苷酸结合寡聚化结构域样受体家族[nucleotide-binding oligomerization domain (NOD)-like receptors, NLR]是存在胞质中的一类重要的PRR，NLR家族中最大的亚家族是含有NACHT-LRR-PYD[NACHT,LRR-and pyrin-domain (PYD)-containing protein, NALP]或称含NLR家族热蛋白结构域蛋白(NLR family pyrin domain containing protein, NLRP)的受体家族。大部分NLRP在识别胞质中不同的PAMP或DAMP后，能够形成炎性复合体。炎性复合体也称炎性小体，是由胞质中的多种PRR参与组装的一类多蛋白复合物，目前已经发现的主要有4种，即NLRP1炎性复合体、NLRP3炎性复合体、IPAF(或称NLRC3)炎性复合体和AIM2炎性复合体。其中，NLRP3炎性复合体由于可被多种结构不同的配体激活，进而参与到痛风、肠炎、糖尿病、阿尔兹海默病、动脉粥样硬化、感染和肿瘤等多种疾病的发生过程，故而成为目前关注最多、研究最为深入的一类炎性复合体[1]。

一、NLRP3炎性复合体的组成和活化

NLRP3炎性复合体由3部分构成(图1)：(1)NLRP3蛋白：由3个结构域构成：①C端富含亮氨酸的重复序列(leucine-rich repeats, LRRs)，负责探测和识别PAMPs/DAMPs；②中央是核酸寡聚化结构域(nucleotide-binding and oligomerization domain, NOD)，也称为NACHT结构域，负责参与NLR的寡聚体化和活化；③热蛋白结构域(pyrin domain，PYD)，位于N端，负责结合接头分子和效应蛋白。(2)凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-lilke protein containing a caspase recruitment domain, ASC)，为接头蛋白。ASC又分为：①caspase募集结构域(caspase-recruitment domain，CARD)，可连接caspase-1前体蛋白；②PYD结构域，以连接NLRP3的同源结构域PYD。(3)caspase-1前体蛋白，为效应蛋白。当NLRP3识别到PAMPs/DAMPs时，发生寡聚化，并与ASC结合，招募caspase-1前体蛋白，形成NLRP3炎性复合体，进而激活caspase-1，caspase-1属于促炎蛋白酶，活化的caspase-1通过剪切的方式活化白细胞介素1β前体(pro-interleukin 1β, pro-IL-1β)和白细胞介素IL-18前体(pro-interleukin 18, pro-IL-18)，从而释放大量成熟的IL-1β和IL-18。近年来的研究表明，caspase-1还可介导细胞焦亡。细胞焦亡是一种致炎性的程序性的细胞死亡，可释放出大量的炎性物质，诱发严重的炎性反应[1]。目前研究者认为NLRP3炎性复合体的活化需要两条信号通路依次激活：(1)启动步骤：Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和其配体相互作用，造成NLRP3 和IL-1β前体被核因子κB(nuclear factor κB，NF-κB)转录，以完成NLRP3炎性复合体活化的准备过程。(2)活化步骤：在持续的PAMPs或DAMPs刺激下，NLRP3通过NACHT结构域发生寡聚化，进而激活NLRP3炎性复合体组装，最终活化效应蛋白caspase-1。此外，另一假说认为，持续的钙离子内流可刺激胞内钙离子升高，环腺甘酸AMP(cyclic AMP，cAMP)降低，介导NLRP3炎性复合体活化[2]。

图1 NLRP3炎性复合体结构示意图PAMPs. 病原体相关分子模式；DAMPs. 损伤相关分子模式； LRRs. 模式识别受体; NOD.NOD样受体蛋白 3； PYD. 热蛋白结构域； CARD.caspase募集结构域

二、线粒体在NLRP3炎性复合体活化中的作用

长期以来，线粒体一直被视为能量工厂，可提供细胞生命活动所需的能量。研究发现线粒体还是固有免疫反应最基本的信号平台之一，在NLRP3炎性复合体的活化过程中发挥着重要的作用[3](图1)。

1.NLRP3炎性复合体活化时NLRP3的线粒体定位：静息状态下NLRP3位于内质网膜，受到NLRP3炎性复合体激活剂作用后，NLRP3和其配体ASC聚集到细胞核周围，分布于线粒体外膜与内质网膜形成的偶联部位。而且已有研究证明，线粒体相关适配蛋白(mitochondria-associated adaptor protein, MAVS)不仅可介导NLRP3募集到线粒体，而且在NLRP3促进IL-1β产生的过程中也发挥功能，是NLRP3 炎性复合体发挥其最佳活性的关键因素[4]。此外，线粒体特有的心磷脂也是NLRP3炎性复合体活化必须的因子，受到利奈唑胺刺激后，NLRP3直接与心磷脂结合，而后NLRP3炎性复合体活化；反之，心磷脂合成受阻则会造成NLRP3炎性复合体活化受到干扰[5]。

2.ROS在NLRP3炎性复合体活化中的作用：机体受到感染时，天然免疫细胞(如巨噬细胞和中性粒细胞)就会发起防御，并产生活性氧(reactive oxygen, ROS)，ROS的主要来源是线粒体。损伤的线粒体释放线粒体DNA(mitochondrial DNA，mtDNA)和线粒体ROS(mitochondrial ROS，mtROS)，这被认为是内源性损伤信号。在尼日利亚菌素、尿酸和ATP刺激引起mtROS水平升高的细胞中，mtROS清除剂可明显减轻NLRP3炎性复合体的活化。同样地，在臭氧诱导的小鼠慢性阻塞性肺气肿模型中，mtROS清除剂也可有效抑制肺组织中NLRP3炎性复合体的表达，说明mtROS是NLRP3炎性复合体的上游信号[6]。在尼日利亚菌素感染的细胞内，氧化的mtDNA可特异性结合NLRP3，介导NLRP3炎性复合体活化，从而导致IL-1β释放增多[7]。而且， mtROS释放后，线粒体电子传递链破坏，进一步引起NLRP3炎性复合体活化[8]。大部分研究支持ROS介导了NLRP3炎性复合体组装和活化，其作用机制有待于进一步明确。然而，Bauernfeind等的研究却表明，ROS仅仅参与了其组件NLRP3的引发阶段，与NLRP3炎性复合体的活化无关。此外，以利奈唑胺、流感病毒、脑心肌炎病毒(encephalomyocarditis virus, EMCV)处理巨噬细胞，均能激活NLRP3炎性复合体，且不需要ROS的参与[7]。

3.钙信号调节NLRP3炎性复合体的活化：线粒体内的钙离子浓度对于ATP合成、线粒体通透性转换孔的开放及细胞质内钙信号的调节具有重要影响。线粒体内钙离子水平过高会导致线粒体功能障碍，进而促进NLRP3炎性复合体的活化。胞外钙离子浓度升高可刺激G蛋白偶联钙敏感受体，然后活化NLRP3炎性复合体和caspase-1。六型分泌系统(T6SS)的效应分子EvpP能够通过降低细胞内钙离子水平，抑制MAPK-JNK通路进而抑制NLRP3炎性复合体的激活[9]。线粒体通透性转换孔持续开放是线粒体损伤的另一特征。有研究者提出持续的钙离子内流和内质网的贮存钙释放，可刺激线粒体钙离子负荷增多和线粒体稳态破坏，引起mtROS水平升高和线粒体通透性增加。这种模型也被用来解释钙离子信号在NLRP3炎性复合体活化中的作用[10]。

4.线粒体分裂蛋白和融合蛋白调节NLRP3炎性小体活化：正常情况下，哺乳动物的线粒体通过不断地分裂、融合维持其形态结构完整，保障正常功能。线粒体动员相关蛋白1(dynamin-related protein 1，DRP1)和线粒体分裂蛋白1(mitochondrial fission protein 1,Fisl)通过相互作用来促进线粒体的分裂。线粒体融合蛋白1(Mitofusin 1，Mfn1)和线粒体融合蛋白2(Mitofusin 2，Mfn2)是线粒体外膜相关蛋白，是线粒体融合的关键蛋白。在DRP1基因敲除小鼠的巨噬细胞，线粒体异常分裂导致NLRP3依赖的caspase-1激活和IL-1β分泌增加。其机制可能是增强细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)信号，介导NLRP3分布于线粒体，从而促进NLRP3炎性子体的组装[11]。

水疱性口腔炎病毒引起丝氨酸-苏氨酸激酶RIP1和RIP3激活时，RIP1和RIP3可刺激DRP1，引起线粒体异常分裂，造成胞质内ROS水平升高，导致NLRP3炎性复合体活化[12]。科罗索酸可通过促使内皮细胞DRP1 Ser637位点发生磷酸化，阻止氧化应激造成的线粒体分裂，进而阻断NADPH氧化酶2(NADPH oxidase 2, NOX2)信号，抑制NLRP3炎性复合体的活化[13]。在RNA病毒感染的细胞中，Mfn2可以和NLRP3 相互作用，诱导NLRP3炎性复合体活化。更直接的证据显示，以流感病毒或EMCV处理Mfn2基因敲除的细胞后，细胞中caspase-1以及IL-1β表达水平显著降低[14]。以上表明， DRP1功能稳定可维持线粒体分裂正常，抑制NLRP3炎性复合体的活化；而Mfn2则可促进NLRP3炎性复合体的活化，导致炎性反应。

5.线粒体自噬抑制NLRP3炎性复合体的活化：细胞自噬是细胞通过溶酶体降解变性的蛋白质和功能失调的细胞器的过程，在细胞保持动态平衡过程中起关键作用。目前，将通过细胞自噬降解线粒体的途径称为线粒体自噬，主要是指在ROS增多、营养缺乏和细胞衰老等刺激下，线粒体发生去极化损伤，损伤的线粒体被特异性包裹入自噬体，并与溶酶体融合，从而降解损伤的线粒体。线粒体自噬可防止NLRP3炎性复合体过度活化造成的炎性反应。在没有炎性复合体激活物的情况下，1-磷脂酰肌醇3-激酶(1-phosphoinosmde-3-kinase/protein kinase B/the mammalian target of rapamycin，PI3K)抑制剂6-氨基-3-甲基嘌呤(3-methyladenine，3-MA)能够抑制自噬，并引起mtROS增加，造成NLRP3依赖的IL-1β分泌的增多[15]。在结核杆菌感染的细胞中，3-MA同样可以可抑制自噬体形成，从而促进IL-1β分泌。与此一致，自噬蛋白微管相关蛋白1轻链-3(autophagy protein microtubule-associated protein 1 light chain-3，LC3)基因敲除小鼠骨髓来源的巨噬细胞中，线粒体损伤增加以及mtROS水平升高，caspase-1活性增强。这一现象也出现在膜突蛋白样Bcl-2作用蛋白1(moesin-like BCL2-interacting protein，Beclin1)基因敲除的小鼠。而且，自噬相关基因16L1(autophagy gene 16L1，Atg16L1)敲除后，小鼠NLRP3炎性复合体活化增多，对葡聚糖硫酸钠诱导的结肠炎更为敏感[15]。此外，sestrin(SESN2)是一种应激诱导蛋白，可通过诱导自噬清除损伤的线粒体，进而抑制NLRP3炎性复合体的活化[16]。作为炎症的主要激活因子，NF-κB也能够促进自噬受体蛋白p62/SQSTM1积累，介导线粒体自噬，促进线粒体清除，抑制NLRP3炎性复合体活化[17]。这些研究表明线粒体自噬可以抑制NLRP3炎性复合体的活化。

6.其他：腺嘌呤核苷酸转运体1(adenine nucleotide translocator 1，ANT1)是线粒体膜通透性转运的中心分子。在NLRP3炎性复合体刺激物的作用下，Src同源-2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(Src homology 2 domain-containing protein tyrosine phosphatase 2, SHP2)转位到线粒体，与ANT1结合并使得ANT1去磷酸化。这一机制能够阻止线粒体膜电位的降低，并抑制mtDNA和mtROS的释放，因此可以阻止NLRP3炎性复合体的过度活化[18]。双磷脂酰甘油是线粒体内膜上的一种特异性磷脂，在线粒体功能发生障碍时，双磷脂酰甘油可作为一种PAMP被NLRP3识别，进而激活NLRP3炎性复合体。而且，通过siRNA抑制双磷脂酰甘油合酶后，caspase-1的激活受到明显抑制，这表明双磷脂酰甘油可促进NLRP3炎性复合体活化，但具体机制尚未完全阐明[7]。

三、中药活性成分的干预作用

图2 线粒体调控NLRP3炎性复合体活化示意图MAVs. 线粒体相关适配蛋白；Drp1. 线粒体动员相关蛋白1； Mfn2. 线粒体融合蛋白2；ANT1. 腺嘌呤核苷酸转运体1；mtDNA. 线粒体DNA；mtROS.线粒体ROS；pro-IL-1β.白细胞介素1β前体；pro-IL-18.白细胞介素IL-18前体；IL-1β. 白细胞介素1β； IL-18. 白细胞介素IL-18

许多中药活性成分能够通过调节线粒体功能抑制多种细胞模型中NLRP3炎性复合体的活化。这些中药活性成分能够抑制ROS过度产生，减轻线粒体损伤，激活自噬，进而抑制NLRP3炎性复合体，减少IL-1β和caspase-1的释放，减轻病理条件下的炎性反应，发挥对细胞的保护作用[17-33]。目前的研究大多限于对药效的评价，而对具体的调控机制研究不够深入。能够通过线粒体调控NLRP3炎性复合体的活化的中药活性成分详见表1，其中以黄酮类最多。黄酮类化合物具有良好的抗氧化活性，这可能是其发挥作用的基础之一。从这些成分所属的中药分析，清热药最多，其次是补虚药。现代药理学研究表明，清热药具有抗感染、抗炎和影响机体免疫功能的作用，补虚药也具有调节机体免疫功能、增强内分泌功能和抗衰老等活性作用。这两类药可能存在更多抑制NLRP3炎性复合体活化的成分，值得深入挖掘。

四、展 望

作为天然免疫的重要成员之一，NLRP3炎性复合体活化对于保护细胞免受病原体损伤十分重要，但其过度活化可能会引发炎性反应，造成组织损伤和器官衰竭。通过影响NLRP3及其配体的线粒体定位，以及线粒体自噬、分裂和融合及通透性等多个环节，线粒体在NLRP3炎性复合体的组装和活化中发挥关键作用。在不同的病理条件及活化刺激条件下，线粒体对NLRP3炎性复合体活化的调节作用也有差异。线粒体损伤并释放损伤信号以及线粒体调节自身稳态的过程，贯穿于线粒体对NLRP3炎性复合体的调控之中。线粒体的膜蛋白能够与NLRP3结合，在NLRP3炎性复合体组装阶段起重要作用；同时这些蛋白也可以影响线粒体分裂和融合，从而调节NLRP3炎性复合体的活化。线粒体自噬可抑制NLRP3过度活化造成的损伤，对机体起到保护作用。

表1 能够通过调节线粒体功能抑制NLRP3炎性复合体活化的中药活性成分及作用机制

综上所述，线粒体结构及功能的正常对于抑制NLRP3炎性复合体过度活化十分关键，维持线粒体稳态可能是调节NLRP3炎性复合体上游信号的重要策略。深入研究NLRP3炎性复合体的线粒体调控机制，有助于更好地认识天然免疫和炎性疾病的生理病理过程，能够为临床治疗提供新靶点。中药有效成分在抑制NLRP3炎性复合体活化方面的研究取得了一定进展，今后寻找更多能调节NLRP3炎性复合体的中药有效成分并进一步研究其作用机制，有望发现理想的NLRP3炎性复合体抑制剂。