MXD3基因在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

梅 杰 徐 瑞 王惠宇 潘佳栋 刘超英

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，美国肿瘤协会预测2018年全美会有超过60000例RCC新增病例和近15000例死亡病例[1]。根据组织学特点和分析特征，RCC被分成许多亚型。主要亚型包括肾透明细胞癌(ccRCC)、肾乳头状细胞癌(pRCC)、肾嫌色细胞癌(chRCC)、肾集合管细胞癌(cdRCC)和未分类肾细胞癌[2, 3]。其中ccRCC是最常见的肾细胞癌亚型，约占70%～75%[2]。通常情况下RCC对传统化疗和放疗疗效不佳，最好的治疗方法是早期外科切除[4]。然而，大量预后不良的ccRCC进展期患者仍然缺乏有效的治疗措施来控制肿瘤恶性进展。因此，探索ccRCC潜在的生物学标志物和治疗靶点对ccRCC的治疗具有重要意义。

转录因子(transcription factors，TFs)被认为是细胞内基因表达的主要调控因子[5]。长期以来，关键TFs的失调被认为是多种肿瘤发生、发展的关键事件。MXD3是碱性-螺旋-环-螺旋转录因子MXD家族成员之一，与其辅因子MAX形成异二聚体，最初被认为是MXD/MAX/MYC转录网络中MYC蛋白的功能拮抗剂[6～8]。MXD3在细胞增殖中发挥重要作用，有报道称MXD3在多种肿瘤中表达失调，并且对少数肿瘤具有临床诊断和治疗价值。MXD3在髓母细胞瘤和神经母细胞瘤中均有高表达，在上述两种肿瘤中均发挥致癌基因的作用[9, 10]。与之相反的是，在前列腺癌和神经纤维瘤病中，MXD3表达降低[10]。然而，尽管MXD3的表达就作用机制在少数几种肿瘤中已有探究，关于MXD3在ccRCC中表达的研究尚未见报道，MXD3对ccRCC的潜在作用还存在很大的探索空间。

本研究中，笔者从癌症基因组图谱数据库(The Cancer Genome Atlas，TCGA)和基因表达汇编数据库(Gene Expression Omnibus，GEO)下载ccRCC中MXD3表达数据和临床病理参数，分析MXD3表达与肾透明细胞癌临床病理学参数之间的相关性及对预后的影响。本研究首次揭示了MXD3在ccRCC中的差异表达及对预后的影响，有望成为ccRCC靶向治疗的新靶点。

材料与方法

1.TCGA数据资料收集：利用UCSC Xena网站(https://xenabrowser.net/)下载肾透明细胞癌患者基因表达谱Level3数据和临床随访资料。整理提取MXD3 mRNA表达数据以及相应的临床资料，其中MXD3表达谱数据已进行lg2(x+1)标准化转化。通过筛选，共保留528例同时包含MXD3表达谱数据与对应的临床随访资料的病例信息，其中有72例肿瘤组织包含配对的正常组织的基因表达数据。根据MXD3表达量，对数据集中的样本按照MXD3的标准化表达量进行由高到低排序，将数据两等分，位于前50%的样本为高表达组，位于后50%的样本为低表达组。

2.GEO数据资料收集：登录GEO(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/)数据库，从数据集中下载ccRCC测序芯片集GSE40435，用于验证ccRCC中MXD3 (ID_REF: ILMN_1711904)的差异表达。GSE40435由Wozniak等[11]在GPL10558平台上使用Illumina HumanHT-12 v4表达串珠芯片获得的ccRCC测序芯片集，包含101个肿瘤组织和与其匹配的正常组织的基因表达谱。

3.生存分析：采用Kaplan-Meier法对保留的528例患者的MXD3 mRNA表达数据与匹配的生存资料进行生存分析。使用COX比例风险模型对可能影响肾透明细胞癌患者预后的参数进行单因素和多因素分析，模型参数采用Omnibus检验法。

4.统计学方法：应用SPSS 25.0统计学软件对数据进行统计分析。采用配对t检验比较肿瘤组织和对应的癌旁正常组织中MXD3表达量。采用ROC曲线评价肿瘤组织和癌旁正常组织中MXD3差异表达的诊断意义。采用χ2检验比较MXD3表达量与临床病理参数关联性，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1.MXD3在肾透明细胞癌中的表达：与癌旁组织比较，TCGA数据库中ccRCC组织的MXD3表达均明显上调(P=0.000，图1A)。笔者进而使用ROC曲线法评估MXD3的差异表达在诊断ccRCC中的潜在价值(AUC=0.897，P=0.000，图1B)，敏感度为83.33%，特异性为91.67%。笔者进一步利用GSE40435微阵列数据验证了MXD3在ccRCC中的差异表达(P=0.000，图1C)，同时也证明MXD3在ccRCC组织中的过表达对鉴别ccRCC组织和癌旁组织具有良好的诊断价值(AUC=0.785，P=0.000，图1D)。

2.MXD3表达与ccRCC临床病理变量的关系：因GSE40435微阵列数据未包含完整的临床病理参数，本研究只纳入了TCGA数据库中的528例患者进行临床病例参数和生存分析。按照MXD3表达量将患者分为MXD3高表达组和低表达组。MXD3表达在性别及年龄方面比较，差异无统计学意义(P=0.465，P=0.296，表1)。在ccRCC的临床分期方面，MXD3表达在较大及发生远端转移的肿瘤中的表达显著增加(P均=0.001)。TNM分期较高者MXD3表达也显著增加(P=0.000)。然而，淋巴结转移阳性患者MXD3表达情况与淋巴结转移阴性患者比较，差异无统计学意义(P=0.213)。此外，MXD3高表达与病理分级密切相关(P=0.001)，详见表1。

图1 MXD3在ccRCC组织及癌旁组织中的表达A.TCGA数据显示ccRCC组织中MXD3的表达明显上调；B.TCGA数据集中MXD3 mRNA差异表达对ccRCC组织和癌旁组织具有良好的诊断价值；C.GSE40435微阵列数据显示ccRCC组织中MXD3的表达明显上调；D.GSE40435微阵列数据集中MXD3 mRNA差异表达对ccRCC组织和癌旁组织具有良好的诊断价值

3.MXD3表达与肾透明细胞癌患者生存的关系：与存活患者比较，死亡患者MXD3的表达明显增加(P=0.000，图2A)。Kaplan-Meier法分析显示，MXD3高表达与ccRCC患者总体生存期缩短显著相关(P=0.000，图2B)。

表1 MXD3 mRNA表达量与肾透明细胞癌患者临床病理学参数的关系

图2 MXD3表达与ccRCC患者预后的关系A.存活患者与死亡患者MXD3表达比较差异有统计学意义；B.MXD3高表达的患者OS明显短于MXD3低表达的患者

4.肾透明细胞癌患者的单因素和多因素生存分析：在总生存率预后因素的单因素COX回归模型中，初诊年龄(P=0.000)、T分期(P=0.000)、N分期(P=0.001)、M分期(P=0.000)、TNM分期(P=0.000)、肿瘤分化程度(P=0.000)、MXD3表达(P=0.000)均与患者预后相关(表1)。多因素COX分析显示MXD3是OS的独立预后因素(HR=2.249，95% CI: 1.350～3.488，P=0.000)。此外，年龄(P=0.008)和M分期(P=0.001)也是ccRCC患者的独立预后指标(表2)。

表2 肾透明细胞癌患者的单因素和多因素生存分析

讨 论

MXD3是MXD家族成员之一，参与调控MXD/MAX/MYC转录网络，通过与MAX竞争性结合而阻断依赖MYC基因转录的激活，被认为是一种肿瘤抑制因子。已有多项研究证实了MXDs与MYC相互作用的可能机制，MXDs的低表达或失活可导致MXDs-MAX二聚体的减少，从而使MYC的功能形式——MYC- MAX二聚体的数量显著增加[12]。MYC编码细胞核转录因子，在包括细胞增殖、生长、黏附、代谢、血管生成、分化和凋亡等真核细胞生物活动中发挥重要作用[13]。此外，大多数人类恶性肿瘤中都被发现存在MYC的表达失调，充当肿瘤发生、发展的致癌基因[14]。

MXD3在少数几种肿瘤中已被确定为一种新的致癌基因，包括髓母细胞瘤、神经母细胞瘤以及急性B淋巴细胞白血病[9,10,15]。一项基于TCGA数据库的研究表明胶质瘤过表达的MXD3受其转录组水平的可变剪接调控[16]。此外，以MXD3为靶点的靶向治疗肿瘤的前景也十分可观。MXD3 siRNA已被报道用于神经母细胞瘤和急性B淋巴细胞白血病的靶向治疗，并对癌细胞的增殖有明显抑制作用[10,17]。目前尚无相关研究报道MXD3在ccRCC中表达及临床意义，因此本研究为较早地关注MXD3在ccRCC中的表达及其与临床病理参数的关系。

通过对TCGA中MXD3表达数据的分析，笔者发现与癌旁组织比较，ccRCC组织中MXD3表达明显上调。笔者采用ROC曲线评价MXD3对ccRCC的诊断价值，结果显示相对敏感度为83.33%，特异性为91.67%。GSE40435微阵列数据集的MXD3表达数据进一步验证了本研究结果，两个独立数据库的结果均表明检测MXD3 mRNA的差异表达是诊断ccRCC的有效方法。此外，MXD3表达量与ccRCC的TNM分期有关，在不同分化程度的肿瘤中差异有统计学意义。上述结果表明，MXD3表达可作为预测ccRCC进展的可靠指标。迄今为止，对于MXD3对人类恶性肿瘤的预后价值还知之甚少。笔者发现MXD3高表达组患者的OS明显低于低表达组。单因素和多因素COX回归分析表明，MXD3表达可作为ccRCC的独立预测因子。

本研究初步分析MXD3表达及其与临床病例参数的关系，表明MXD3表达的上调是ccRCC潜在的生物学标志物和独立的预后指标。同时，MXD3可能成为一个新的抗癌治疗靶点，可能改善ccRCC患者的预后。虽然本研究已经初步证明MXD3是一种新的ccRCC诊断和预后标志物，但本研究也存在一些局限性。主要的缺点是TCGA和GEO数据库只提供了MXD3在mRNA水平上的表达，这或许不能完全代表MXD3在蛋白水平上的表达及活化程度。MXD3参与ccRCC发生、发展的可能机制还有待于进一步研究。