应用MTT法对恶性肿瘤原代细胞培养进行规范化体外药敏试验的研究

李恒善 云耀峰 梁润 郝灵芳 苍宏宇

【摘要】 目的 探究应用四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法对恶性肿瘤原代细胞培养进行规范化体外药敏试验的可行性和实用性。方法 30例恶性肿瘤患者的新鲜肿瘤组织， 进行原代细胞培养纯化。采用MTT比色法规范化检测12种肿瘤化疗药物对人恶性肿瘤原代细胞培养进行体外药敏试验。结果 紫杉醇、多西他赛对胃癌和结直肠癌原代培养细胞的药物敏感性均为77.78%， 而对乳腺癌原代培养细胞的药物敏感性为88.89%;阿霉素对结直肠癌、胃癌以及乳腺癌原代培养细胞的药物敏感性依次为66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次为77.78%、77.78%、66.67%;环磷酰胺和顺铂依次为66.67%、88.89%、77.78%;卡铂依次为55.56%、77.78%、77.78%;奥沙利铂依次为77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次为77.78%、66.67%、55.56%;吉西他濱依次为66.67%、77.78%、66.67%;长春瑞滨依次为77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次为66.67%、77.78%、77.78%。结论 MTT法对于临床合理用药， 实现肿瘤患者的个体化化疗具有重要的价值。

【关键词】 四甲基偶氮唑盐比色法;恶性肿瘤;药敏试验;化疗

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2020.03.094

MTT法为一种用于检测细胞生长和存活的方法[1， 2]， 主要是通过测定活细胞内线粒体能量代谢过程中的脱氢酶将MTT代谢还原为不溶性紫色的甲簪沉淀产物， 而死细胞不着色[3， 4]。通过MTT染色及个性化筛选， 为临床更好的使用化疗药物对恶性肿瘤细胞进行化疗治疗提供参考依据。本研究将对MTT法进行系统性的研究。现报告如下。

1 资料与方法

1. 1 一般资料 选取本院2018年6月～2019年5月行初次手术的30例恶性肿瘤患者作为研究对象。其中， 男22例， 女8例;年龄26～72岁， 平均年龄（52.6±8.87）岁;乳腺癌12例， 胃癌9例， 结直肠癌9例。

1. 2 方法

1. 2. 1 化疗药物的配制 分别选取紫杉醇、多西他赛、阿霉素、表阿霉素、环磷酰胺、顺铂、卡铂、奥沙利铂、氟尿嘧啶、吉西他滨、长春瑞滨、依托泊苷12种常见化疗药物， 均为临床用注射针剂， 用肿瘤细胞选择性培养基配制。配好的实验药物置于-20℃保存， 应用时需提前放置室温。

1. 2. 2 恶性肿瘤组织的取材 选取患者的新鲜肿瘤组织， 取材时应避开破溃、坏死及液化部分， 以防污染。每例标本应于离体后5～20 min内取材， 要求标本直径约0.5～1.0 cm， 剩余肿瘤组织用于病理， 取材后经无菌生理盐水冲洗后立即置无菌DHanks液中（保证肿瘤组织湿润及营养）带回实验室， 并于30 min内进行分离培养。

1. 2. 3 恶性肿瘤细胞的培养纯化 于超净工作台内取出标本， 去除肿瘤组织周围的脂肪、血管、纤维和坏死组织， 然后用平衡至常温的DHank s液漂洗2～3遍至无血迹同时冲去废弃组织。以手术刀和眼科剪迅速将标本剪碎呈糊状（大小约为1～2 mm3）。用消化培养法进行原代细胞培养， 加入0.25%的胰蛋白酶， 37℃条件下消化20 min后用含有血清的培养基终止消化， 离心弃去上清， 磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗3次。

应用振荡法使细胞充分散开， 经200目（直径0.76 mm）不锈钢无菌滤网过滤， 弃去脂肪和较大的未解离组织。将最终收获的肿瘤细胞置入25 cm2细胞培养瓶中。应用肿瘤细胞选择性培养基在37℃， 5% CO2饱和湿度培养箱内进行培养纯化。

1. 2. 4 恶性肿瘤细胞MTT法药敏试验 将培养纯化得到的恶性肿瘤细胞， 制成细胞悬液， 调整细胞浓度为106/ml待用。本试验根据所要检测的化疗药物种类分为多个治疗组， 另设一个阴性对照组和空白对照组， 每组复置3孔。具体加样情况如下：治疗试验组：肿瘤细胞悬液100 μl/孔+化疗药物10 μl/孔+肿瘤细胞选择性培养基90 μl/孔（药物终浓度为体内血浆高峰浓度10倍）;阴性对照组：肿瘤细胞悬液

100 μl/孔+肿瘤细胞选择性培养基100 μl/孔;空白对照组：肿瘤细胞选择性培养基200 μl/孔;将加好样的96孔无菌培养板， 置37℃、5%的CO2饱和湿度培养箱中培养48 h后， 每孔中加入MTT溶液（5 mg/ml）20 μl， 上述条件继续培养4 h， 离心弃上清， 再加甲臜溶剂三联液100 μl， 于37℃放置过夜， 待甲臜结晶彻底溶解后， 在酶标仪上比色， 测出每孔在波长570 nm波长处吸光度A值。药物对肿瘤细胞的抑制率=[1-（治疗试验孔平均A值/阴性对照孔平均A值）]×100%。抑制率>50%为高度敏感， 抑制率30%～50%为中度敏感， 抑制率<30%为耐药。

2 结果

紫杉醇、多西他赛对胃癌和结直肠癌原代培养细胞的药物敏感性均为77.78%， 而对乳腺癌原代培养细胞的药物敏感性为88.89%;阿霉素对结直肠癌、胃癌以及乳腺癌原代培养细胞的药物敏感性依次为66.67%、55.56%、55.56%;表阿霉素依次为77.78%、77.78%、66.67%;环磷酰胺和顺铂依次为66.67%、88.89%、77.78%;卡铂依次为55.56%、77.78%、77.78%;奥沙利铂依次为77.78%、88.89%、88.89%;氟尿嘧啶依次为77.78%、66.67%、55.56%;吉西他滨依次为66.67%、77.78%、66.67%;长春瑞滨依次为77.78%、66.67%、66.67%;依托泊苷依次为66.67%、77.78%、77.78%。见图1。

3 讨论

恶性肿瘤治疗采取化疗方案的个体化一直是临床工作中的一个难题， 因此， 科研人员不断经过摸索建立了多种肿瘤药物化疗的药敏检测方法[5]。MTT法具有多种优点， 为目前进行肿瘤药敏试验最有效的方法之一[6， 7]。

MTT法可有效反映肿瘤细胞对化疗药物的敏感性， 与临床疗效的相关性较好。然而， MTT方法也存在局限性， 其尚未有一个公认的统一技术顺序[8]。因此， 本研究主要对MTT方法学进行系统研究， 针对该方法操作的各环节如细胞浓度、受试药物浓度、细胞培养时间、MTT培养时间等进行合理优化和选择， 进而确定本实验室的MTT法规范化操作流程。通过MTT法对人恶性肿瘤原代培养细胞进行规范化体外药敏试验发现， MTT法可较准确的反映不同肿瘤患者对12种不同肿瘤化疗药物的敏感性差异别， 其检测结果与临床疗效具有较好的吻合性。此外， 与以往传统肿瘤药敏试验相比， 本研究在肿瘤原代细胞培养纯化方面进行了明显改进， 可大量减少成纤维细胞及人体其他正常组织成分对药敏试验的干扰， 具有一定创新性。

综上所述， 本研究通过MTT法对恶性肿瘤原代细胞培养进行规范化体外药敏试验， 确定了该试验的操作流程。

参考文献

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[收稿日期：2019-05-21]