醋酸艾司利卡西平有关物质HPLC分析方法研究

2020-03-30温秀红吴小翠

山东化工 2020年4期

温秀红，吴小翠，郭芳,肖引

(1.西安新通药物研究有限公司，陕西西安 710077；2.武警陕西省总队医院，陕西西安 710054)

1 引言

醋酸艾司利卡西平是 Sunovion Pharma 开发的 S-利卡西平醋酸酯前药，是一种新型抗癫痫药物，S-利卡西平是奥卡西平的主要活性代谢产物，通过阻止电压门控钠通道来产生抗惊厥作用[1]。醋酸艾司利卡西平口服吸收快、半衰期长、药物动力学呈线性，无明显的药物相互关系。与卡马西平、奥卡西平相比较，醋酸艾司利卡西平治疗效果更加显著[2]。醋酸艾司利卡西平于2009年在欧洲上市，商品名为Zebinix，2013年被 FDA 批准用于成人癫痫部分性发作，目前国内还未上市[3-4]。目前，2015版《中国药典》、《美国药典》、《英国药典》和《欧洲药典》均未收载本品质量标准，因此，本文对自主研发合成工艺路线下可能产生的杂质进行分析，对醋酸艾司利卡西平有关物质开发了相应的分析方法，并对其进行方法学研究。

2 仪器与试药

岛津LC-2010AHT 高效液相色谱仪；梅特勒GB204电子天平；醋酸艾司利卡西平对照品(批号：D140302，来源：西安新通药物研究有限公司)；起始物料(批号：BH-AB03081-140316，来源：上海瀚鸿化工科技有限公司)；中间体I(批号：ESL-1-140402，来源：西安新通药物研究有限公司)；中间体II(批号：ESL-2-140402，来源：西安新通药物研究有限公司)；杂质A(批号：A140301，来源：西安新通药物研究有限公司)；奥卡西平(批号：100657-201102，来源：中国药品生物制品检定所)；环氧化物(批号：14-AZC-52-1，来源：加拿大TRC公司)；磷酸氢二钾(分析纯)，甲醇(色谱纯)，乙腈(色谱纯)，水为纯化水。

3 杂质分析

根据我们自主研发的合成工艺，本品可能引入的杂质情况如下：(1)从合成工艺路线分析，以10-甲氧基亚氨基芪为起始物料，反应生成中间体I，中间体I经过不对称还原反应后生成中间体II和中间体II对映体，再经过乙酰化反应后，与氯磺酰异氰酸酯发生取代反应得到醋酸艾司利卡西平。(2)本品为乙酸酯类，不稳定，容易在碱性中水解，生成杂质A。(3)本品结构中的手性来源于不对称还原反应过程，故成品中可能还会存在对映异构体。(4)本品体内代谢产物可能产生奥卡西平及卡马西平环氧化物。综合上述分析结果，本品中主要杂质：各反应中间体、水解杂质A、奥卡西平及卡马西平环氧化物以及对映异构体。

4 方法与结果

4.1 色谱条件[5]

色谱柱：sepax C-18(150 mm×4.6 mm,5 μm填料)；流动相A为0.01 mol/L磷酸氢二钾-甲醇(80∶20)，流动相B为乙腈-甲醇-水(75∶5∶20)，梯度洗脱程序见表1；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 μL。

表1 梯度洗脱程序Tab.1 Gradient elution procedure

4.2 专属性

4.2.1 样品配制

空白溶剂：甲醇。

系统混合溶液：称取起始原料、中间体Ⅰ、中间体Ⅱ、杂质A、奥卡西平和环氧化物约10mg，分别置25mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液，分别取奥卡西平和环氧化物杂质储备液50μL，取起始原料、中间体Ⅰ、中间体Ⅱ、杂质A储备液250μL，置含有醋酸艾司利卡西平约10mg 的25mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。

表2 强制降解样品制备Tab.2 Preparation of forced degradation sample

4.2.2 测定方法

分别取上述溶液个10μL，注入液相色谱仪，记录色谱图，见图1～图4。

4.2.3 结果

图1 有关物质混合溶液色谱图Fig.1 chromatogram of related compound for Mix solution

图2 强制降解重叠图(1)Fig.2 overlap chromatogram of forced degradation(1)

图3 强制降解重叠图(2)Fig.3 overlap chromatogram of forced degradation(2)

4.2.4 峰纯度试验

选用强制降解样品溶液，在带光二极管阵列检测器的液相色谱仪中进样，检测峰纯度。结果显示强制降解溶液和未降解溶液的主峰峰纯度大于其单点纯度阈值，可表明在此实验条件下，主峰中未包裹其他杂质，表明本系统适用性良好。

4.2.5 结论

从上述系统溶液看出，各杂质的分离度均符合要求。从上述强制降解试验数据可以看出，杂质A主要在酸碱破坏条件下产生，且均为主要降解杂质，是由本品结构中七元环上的酯键断裂形成。其他条件下，几乎没有杂质降解产生。在各降解条件下，主峰纯度良好，未包裹其他杂质，杂质之间以及杂质与主峰之间的分离度良好，色谱条件良好。

4.3 线性关系考察

取醋酸艾司利卡西平对照品约25 mg ，置25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL 置100 mL量瓶中，再精密量入浓度为0.04 mg/mL的各杂质储备液各1 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为测定溶液。精密吸取测定溶液5,8,10,12和15 μL，按"4.1"项下色谱条件进样分析，以浓度(X,ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果显示，各杂质在约相当于供试品进样量的0.05%～0.15%范围之间，线性关系良好，见表3。

图4 强制降解重叠图(3)Fig.4 overlap chromatogram of forced degradation(3)

表3 线性关系Tab.3 linear relation

4.4 重复性试验

取本品约10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液，分别配制6份，精密吸取10 μL进样，记录色谱图。结果显示，6份供试品溶液杂质量均无明显差异，均只检出一个未知杂质，未知杂质含量均为0.06%，表明重复性良好。

4.5 回收率试验

取本品约10 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为本底溶液，精密量取本底溶液1 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液；再精密量取含起始原料，中间体I，中间体II，杂质A，奥卡西平和环氧化物约 0.004 mg/mL的各杂质溶液125,250和375 μL，分别置于已加入本品约10 mg的25 mL量瓶中，加甲醇溶解稀释至刻度，摇匀，分别作为限度浓度50%、100%和150%的溶液，平行配置三份。分别精密量取上述溶液10 μL，记录色谱图，各杂质按照加校正因子的自身对照法计算测得量，将测得量减去本底含量，除以加入量计算回收率。结果起始物料、中间体I、中间体II、杂质A、奥卡西平、环氧化物回收率分别为91.8%,90.8%,86.9%,99.9%,87.2%和87.9%，RSD分别为6.6%,5.9%,4.3%,5.4%,4.4%和4.7%。

4.6 检测限与定量限试验

取醋酸艾司利卡西平适量，加甲醇配制成一定浓度的溶液，按信噪比S/N应不小于3和信噪比S/N应不小于10分别确立检测限和定量限。同时计算检测限和定量限时进样浓度。结果表明，当样品浓度为0.4 mg/mL时，定量限符合检测灵敏度要求，能被有效检出。

4.7 稳定性试验

取本品约10 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，做为供试品溶液，放置于室温条件下，分别在0,2,4,6和8 h进样，记录色谱图。图谱显示，供试品溶液随着放置时间的延长，杂质A降解产生，在8 h内由未检出增长到0.07%，表明供试品溶液不稳定，因此需临用新制。

4.8 耐用性试验

称取起始原料、中间体Ⅰ、中间体Ⅱ、杂质A、奥卡西平和环氧化物约10 mg，分别置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为杂质储备液，分别取奥卡西平和环氧化物杂质储备液50 μL，取起始原料、中间体Ⅰ、中间体Ⅱ、杂质A储备液250 μL，置含有醋酸艾司利卡西平约10 mg 的25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为混合溶液。分别选用色谱柱sepax C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)、DIKMA C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)、IntertSustain C-18(4.6×150 mm，5 μm)和Xtimate C-18柱(4.6×150 mm，5 μm)及岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪和waters alliance 2486高效液相色谱仪进行测定。结果表明，当更换不同色谱柱，更换不同型号和品牌色谱仪器时，虽然杂质和主峰保留时间有所差异，主峰的保留时间在10～17 min之间变化，但均能实现各已知杂质与主峰的分离和检测，方法耐用性良好。