术前miR-376c-3p水平与宫颈癌临床病理特征及预测术后复发价值

李彩荣 吴大保

中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)(合肥，230001)

宫颈癌是临床发病率最高的妇科恶性肿瘤，分期较早患者及时行根治性手术是最理想方案，但患者术后存在一定复发概率，影响复发的直接因素尚未明确且是目前临床研究重点[1-2]。miRNA是一类由内源基因编码、长度为22 个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与多个生命过程且被发现在不同恶性肿瘤的发生发展中扮演一定角色。miR-376c-3p是miRNA亚型，已被证实在调控人胃肠道间质瘤细胞[3]、宫颈癌细胞[4]恶性行为方面具有直接作用，但在组织中的表达变化及可能产生的影响研究极少。本研究探讨早期宫颈癌患者术前病灶组织中miR-376c-3p的表达变化及与临床病理特征的关系，对术后复发的预测等，为宫颈癌靶向干预寻求可能指标。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月-2015年1月在本院行宫颈癌根治术的原发性宫颈癌患者作为宫颈癌组。纳入标准：①经术中冰冻及术后病理结果明确原发性宫颈癌；②国际妇产科联盟(FIGO)分期为Ⅰ-Ⅱa期，符合宫颈癌根治术指征；③术前进行宫颈病灶组织活检；④广泛子宫切除术+盆腔淋巴结清扫术；⑤年龄≥18周岁；⑥本人签署知情同意书并配合后续随访。排除标准：①术前放化疗或者其他治疗史；②合并严重基础性心肝肾功能不全；③术后3月内死亡病例。同期本院行宫颈活检并诊断为宫颈上皮内瘤变患者为宫颈良性病变组，入组前3月无宫颈局部治疗史、本人签署知情同意书。本研究通过医院伦理审核。

1.2 宫颈组织中miR-376c-3p检测

宫颈活检组织标本在离体30min内迅速冻存于液氮罐中，复温后采用RNAiso Plus试剂提取组织RNA并检测其完整性，使用紫外分光光度计测定RNA纯度、浓度。采用microRNA逆转录试剂盒进行逆转录，反应体系：miRNA ReactionBuffer Mix 10μl，miRNA Prime Script RTEnzyme Mix 2μl，0.1%BSA2μl，Total RNA 1μl，最后用不含RNA酶的dH2O补足至20μl。反应条件：37℃ 60min→85℃ 5s，产物﹣20℃备用。聚合酶链式反应(PCR)扩增：miR-376c-3p引物序列5’-AGCTGTAGCCGTAACGTAGT，3’-CTTGAACGTAAGCTGGAGCT，反应体系：PCR正向引物0.8μl、PCR反向引物0.8μl、SYBR Premix ExTaqTMⅡ10μl，ROX参比资料Ⅱ0.4μl，DNA模板2.0μl，用不含RNA酶的dH2O补足至20μl。反应条件如下：95℃ 30s→95℃ 3s→60℃ 30s，共40个循环。当目标基因的扩增效应与内参照基因相同时，以U6为内参考，测定Ct值并计算△Ct值，以2﹣△△Ct表示miR-376c-3p的相对表达水平。

1.3 术后随访

电话随访，以宫颈癌根治术完成当日作为随访起点，以2020年1月1日或之前宫颈癌复发时间为随访终点。手术后复发：成功完成宫颈癌根治术、术中标本切缘阴性，手术结束6个月后出现新发肿瘤且与原发肿瘤细胞一致，最终以病理组织学或者PET/CT等影像学检查共同诊断。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 基本情况

根据标准累计纳入90例患者进入宫颈癌组，年龄(54.4±7.1)岁(39～76岁)，体质指数(BMI)(23.4±2.6)kg/m2(21～26 kg/m2)；宫颈良性病变组100例，年龄(53.2±6.5)岁(37～73岁)，BMI(23.4±2.6)kg/m2(21～27 kg/m2)。两组比较无差异(P>0.05)。术前病灶活检组织中miR-376c-3p的表达水平宫颈癌组(0.65±0.08)低于宫颈良性病变组(0.86±0.10)(t=15.869，P=0.000)。

2.2 宫颈癌组miR-376c-3p表达与临床病理特征

宫颈癌组患者术前miR-376c-3p表达水平，在不同肿瘤最大直径、FIGO分期、淋巴结转移、间质浸润深度等存在差异(P<0.05)，不同年龄、月经状态、病理类型等无差异(P>0.05)。见表1。

表1 宫颈癌组不同临床病理特征与miR-376c-3p表达水平比较

2.3 宫颈癌患者miR-376c-3p表达水平与无复发生存时间

90例入组患者均获得有效随访，根据miR-376c-3p表达水平中位数将所有宫颈癌患者分为高miR-376c-3p组、低miR-376c-3p组。高miR-376c-3p组的无复发生存时间中位数63个月，无复发生存率为88.9%(40/45)；低miR-376c-3p组的无复发生存时间中位数为50个月，无复发生存率为80.0%(36/45)。Kaplan-Meier生存曲线显示，高miR-376c-3p组的无复发生存状况优于低miR-376c-3p组(P<0.05)，见图1。

图1 宫颈癌患者不同miR-376c-3p水平无复发生存时间比较

2.4 术前miR-376c-3p表达水平对宫颈癌患者术后复发的预测价值

术前miR-376c-3p表达水平预测宫颈癌患者术后复发的截点为0.625，对应的曲线下面积(AUC)为0.688(95% CI：0.544～0.833)，灵敏度及特异度分别为52.6%、78.6%。

3 讨论

miR-376c-3p是近年研究较多的miRNA亚型。Bhavsar[5]发现miR-376c-3p可靶向细胞周期蛋白D1并诱导神经母细胞瘤细胞的增殖阻滞；Zhang[6]认为miR-376c-3p可通过下调LncRNA-LINC00152而降低结直肠癌细胞的恶性行为、促进其凋亡。miR-376c-3p在宫颈癌中的研究也有一定开展，刘晓娟等[4]研究发现长链非编码RNA linc00152(LINC00152)可靶向下调miR-376c-3p表达并促进宫颈癌细胞恶性进展。关于miR-376c-3p在宫颈癌中研究涉及极少，本文发现宫颈癌病灶组织中miR-376c-3p表达水平较宫颈良性病变者存在明显下降，这与既往细胞研究中miR-376c-3p的表达变化趋势吻合，说明在宫颈癌患者中低表达的miR-376c-3p也参与了疾病的发生发展。

宫颈癌患者病情严重程度多与病理特征密切相关，尤其肿瘤分期、淋巴结转移等直接决定疾病严重程度[7-9]。本文分析发现肿瘤最大直径≥4cm、FIGO分期Ⅱa期、合并淋巴结转移、间质浸润深度≥2/5的宫颈癌患者术前病灶组织中miR-376c-3p的表达水平较低，提示miR-376c-3p表达水平持续降低预示着宫颈癌病情较为严重。Zhang[10]研究认为上调miR-376c-3p可通过靶向ING5减轻葡萄糖缺氧诱导的细胞损伤; Liu[11]在对miR-376c-3p影响胃癌细胞的机制分析发现，miR-376c-3p通过靶向SYF2并降低SYF2表达并抑制胃癌细胞的增殖、迁移。miR-376c-3p表达水平降低促进宫颈癌恶性进展的具体机制是否与上述两种途径相似目前不得而知，有待后续开展分子研究进一步明确。本文中不同年龄、月经状态、病理类型的宫颈癌患者术前miR-376c-3p表达水平未见差异，可能与这些特征对宫颈癌恶性程度的影响较小有关。

本文中宫颈癌患者处于FIGO分期Ⅰ-Ⅱa期，均符合根治性手术指征，其术后复发与否及复发时间等对患者生存结局产生至关重要影响[12-14]。术后长期随访，经Kaplan-Meier生存曲线分析发现，高miR-376c-3p组患者中位无复发生存时间较长且整体无复发生存状况较优。进一步明确了术前miR-376c-3p低表达可能预示着根治性手术后复发较早，推测与miR-376c-3p水平降低后对肿瘤细胞增殖、迁移行为的抑制减弱，导致术后微小残留病灶复发或者细胞癌变再次发生。进一步经ROC曲线发现，术前miR-376c-3p表达水平预测乳腺癌患者术后复发的截点为0.625，对应的AUC为0.688，灵敏度及特异度分别为52.6%、78.6%，提示术前宫颈病灶组织miR-376c-3p水平对根治术后复发有一定预测价值，可能对日后患者的干预方案调整有实践意义。

综上所述，宫颈癌患者术前病灶组织中miR-376c-3p表达水平异常降低，且与肿瘤最大直径、FIGO分期、淋巴结转移、间质浸润深度等临床病理特征有关，在判断术后无复发生存时间、预测术后复发风险方面均有一定价值。本研究也存在局限，如纳入例数有限、未涉及miR-376c-3p影响宫颈癌病情的分子机制等，有待后续大样本临床研究、深入的基础研究等明确。