辅助生殖胚胎培养D2细胞数与卵裂期选择性单胚胎移植临床结局

魏玉兰 靳 镭 黄 博 任新玲

华中科技大学同济医学院附属同济医院(武汉,430030)

选择性单胚胎移植(eSET)以其降低多胎妊娠率、改善母婴围产结局的优势成为辅助生殖技术的趋势,而挑选出最具发育潜能的胚胎移植成为关注焦点[1]。单囊胚移植可在保持理想妊娠率的基础上降低多胎妊娠率,但存在部分患者无囊胚形成从而取消移植的风险。国内多数生殖中心选择在受精后第3天(D3)进行卵裂期胚胎移植,但移植胚胎多为2个,卵裂期单胚胎移植尚少有临床研究报道。本研究探讨了单个卵裂期胚胎移植周期中在D3优质胚胎为8细胞的前提下,第2天(D2)不同细胞数对临床结局的影响,以期优化胚胎选择方案,提高eSET临床妊娠率。

1 资料与方法

1.1 研究对象及纳入标准

收集本中心2016年1月—2018年12月行辅助生殖新鲜周期行eSET患者的临床资料,以D3为单个优质8细胞胚胎的移植周期为研究对象(n=2375),根据D2细胞数不同分组,比较2、3、5、6细胞组与4细胞组的临床妊娠率、活产率及流产率。纳入标准：①女方年龄≤35岁；②D2胚胎卵裂球无多核表现；③D3移植单个来源于正常受精的优质8细胞胚胎；④夫妇双方染色体正常；④排除遗传性疾病。本研究经本院伦理委员会审批。

1.2 治疗方法

1.2.1促排卵及体外授精促排卵方案按照本院生殖中心常规治疗方案,根据女方年龄、基础卵泡及基础内分泌等情况选择不同促排方案(短效长方案,卵泡期长方案,拮抗剂方案,黄体期方案等)。B超监测卵泡发育情况,卵泡成熟时,注射HCG(珠海丽珠制药,5000IU)5000～10000U,37h经阴道超声引导下穿刺取卵。密度梯度离心法优化精液并根据患者不孕不育相关因素及精子质量选择实施常规IVF或单精子卵胞浆内注射(ICSI)操作。

1.2.2胚胎评估时间及方法根据伊斯坦布尔共识,正常授精后17±1 h观察原核, 44±1 h观察D2胚胎,68±1 h观察D3胚胎,评估细胞数目、碎片比例、卵裂球大小是否均匀[2]。

1.2.3胚胎评估方法D3卵裂期胚胎评分标准：Ⅰ级,卵裂球数8～10个,卵裂球大小均匀且碎片≤10%；Ⅱ级,卵裂球数8～10个,卵裂球大小均匀或轻度不均且碎片<25%；Ⅲ级,卵裂球大小严重不均且碎片<50%,或卵裂球无大小严重不均、碎片25%～50%；Ⅳ级,碎片≥50%。

1.2.4胚胎处理方案选择D2～D3胚胎继续发育,卵裂球大小均匀或轻度不均,无碎片或碎片≤10%且D3细胞数为8细胞的胚胎为移植首选,余下胚胎冷冻或继续培养。

1.3 临床妊娠诊断

胚胎移植后14d抽取患者静脉血查绒毛膜促性腺激素(β-HCG),阳性者14d后经阴道B超监测有原始心管搏动及孕囊者为临床妊娠。

1.4 统计学处理方法

2 结果

2.1 各组一般临床资料比较

各组女方年龄、不育年限、体质指数(BMI) 、HCG日内膜厚度、促性腺激素(Gn)使用总量等比较均无差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组一般临床资料比较

2.2 各组临床结局比较

4细胞组临床妊娠率、活产率高于2、3、6细胞组(P<0.05),但与5细胞组无差异(P>0.05)；流产率各组均无差异(P>0.05)。见表2。

表2 各组临床结局比较[例(%)]

3 讨论

细胞数目直接反映胚胎的发育速度,是胚胎内在潜能的一种表现。现有研究表明D3 8细胞胚胎具有植入能力较强[3]及染色体异常率较低[4]的优势；同时也有研究表明D2 4细胞胚胎与非4细胞胚胎相比具有较高的体外发育能力和体内着床潜能[5]。正常受精后D2 4细胞、D3 8细胞是胚胎最为理想的状态,但经常会出现D3是优质8细胞胚胎而对应的D2胚胎却是发育速度不一的非4细胞状态。目前D2具体细胞数与D3卵裂胚临床结局之间的关联尚少有报道,因此本研究探讨了D2不同细胞数对临床结局的影响,以期为综合分析和选择胚胎提供参考。

Desai等[6]认为细胞数目是评估胚胎最重要的指标,可作为胚胎活力和妊娠结局的有效预测指针。正常受精后44±1h观察D2胚胎形态,此阶段卵裂球数目也就是卵裂速度对临床结局有非常重要意义。De Placido等[7]也认为胚胎发育速度与临床结局显著相关。从本研究数据来看,4细胞组临床妊娠率、活产率最佳,提示D2 4细胞是D3选择优质胚胎的重要参考。

发育速度较慢的2、3细胞组临床妊娠率、活产率均明显低于4细胞组,流产率虽与其他各组相比较无统计学差异但明显偏高。Somfai等[8]发现,缺乏潜力发育到囊胚的胚胎第1次卵裂时间显著长于正常胚胎。据研究报道过慢的胚胎发育速度可能代表卵子内在发育能力的严重缺陷或染色质的异常[9]。虽然此类胚胎可以通过后续不断的自身修复越过迟缓期至D3发育为8细胞胚胎但最终大部分胚胎可能因发育潜能受限被淘汰而无法获得妊娠。

另外,本研究中发育速度较快的5细胞组临床妊娠率,活产率与4细胞组无差异,但6细胞组与4细组相比,临床妊娠率、活产率均下降,提示D2发育过快的胚胎移植后着床能力较低。针对发育速度过快,Magli等[4]和Ambartsumyan等[10]研究报道胚胎发育速度过快可能会增加胚胎染色体异常。Van Royen等[11]对<38岁患者进行研究,认为胚胎卵裂速度过快预示其继续发育潜能的有限性。另外,此类胚胎中的一些卵裂球可能不是真正的胚胎细胞而只是较大的无核碎片[12]。

与以往研究[3,5]报道不同,本研究中5细胞组并未因为发育速度较快而出现植入率下降,反而其临床妊娠率、活产率较理想,与4细胞组无差异。原因可能为,既往研究对D3细胞数无明确界定,而D3细胞数也是评估胚胎潜能的重要参数[3,13]。本研究不同的是D3为优质8细胞,明确了研究对象,对卵裂胚移植的筛选更有临床价值。 此外也可能与本研究对象更年轻(≤35岁)以及近年技术和培养体系的改进有关。基于本研究结果,我们认为在D2缺乏4细胞的情况下,5细胞也是较好的选择,4细胞和5细胞可同时列为D2优质胚胎。

卵裂模式包括正常卵裂及异常卵裂,而胚胎出现非整倍体或基因异常是诱发卵裂模式异常的主要原因。刘丽等[14]的研究显示胚胎早期发育阶段会出现高比例的卵裂行为异常,在381个D3胚胎的卵裂中异常卵裂占65.35%。而Athayde等[15]也认为异常卵裂在胚胎发育中普遍存在,部分通过形态学参数静态评估的优质胚胎,可能表现为卵裂模式异常,而异常卵裂的胚胎发育潜能低下,严重影响妊娠结局。Yang等[16]报道了异常卵裂模式可造成胚胎染色体异常,导致妊娠率降低,流产率升高。本研究中D2发育较慢的2、3细胞及发育较快的5、6细胞至D3均发育为8细胞,本身就存在前后发育速度不均而增加了异常卵裂风险,其临床妊娠率较低可能与此有关。提示有条件的医疗中心可配备时差成像系统(TLI),利于持续和动态观察胚胎发育,便于发现卵裂模式异常的胚胎。

综上所述,D3优质8细胞胚胎结合D2细胞数进行综合评估有利于挑选最具发育潜能的胚胎。在D3优质胚胎为8细胞的前提下D2 4细胞是首选,5细胞同样可列为优质胚胎作为备选。