侵染广东连州葫芦的黄瓜绿斑驳花叶病毒的分子特征及致病性分析

2020-03-30李正刚农媛汤亚飞佘小漫于琳蓝国兵邓铭光何自福

中国农业科学 2020年5期

李正刚，农媛，汤亚飞，佘小漫，于琳，蓝国兵，邓铭光，何自福

（广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州510640）

0 引言

【研究意义】黄瓜绿斑驳花叶病毒（Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV）隶属于帚状病毒科（Virgaviridae）烟草花叶病毒属（Tobamovirus）[1]，该属病毒的特点是极易通过机械摩擦进行传播。CGMMV可以侵染黄瓜、葫芦、甜瓜、西瓜等葫芦科作物，造成植株生长迟缓、叶片褪绿斑驳、果实变色和纤维化，导致严重损失[2-5]。CGMMV是典型的种传病毒[6-7]，是我国植物检疫性有害生物[4]。因此，对CGMMV进行监测及鉴定，有利于对该病毒进行预防，减轻该病毒造成的危害，对葫芦科作物的可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】CGMMV是正义单链RNA病毒，全长约6 400 nt，编码4个蛋白，分别为129 kD的复制酶、186 kD的复制相关蛋白、29 kD运动蛋白和17.4 kD的外壳蛋白[8]。CGMMV最早是在英格兰发现的[9]，随后在全世界范围内陆续被报道[10-16]。CGMMV在世界范围的传播可以分为3个时期[17]：1935—1985年，该时期CGMMV在全球的传播速度较慢，仅局限在欧洲、中东、南亚和东亚少数几个国家以及中国台湾等地区[17-20]；1986—2006年，该时期CGMMV在全球传播的速度有所加快，已传播至欧洲大部分国家[17]，在亚洲包括南亚的巴基斯坦，东亚的中国和韩国，东南亚的印度尼西亚和泰国，中东地区的以色列、沙特阿拉伯和叙利亚[11,17,21-27]；2007—2016年，该时期CGMMV传播速度更加迅速，传播至更多的国家和地区[17]，加拿大、美国、尼日利亚、澳大利亚这些国家也陆续发现了CGMMV[17,28-30]。中国大陆于2005年在广西南瓜上最早报道CGMMV，目前已经在山东、河北、湖北、云南、广东、辽宁等多地普遍发生[3,22,31-33]，并对多地的瓜类作物造成了毁灭性的损失[2,4]。【本研究切入点】CGMMV广东分离物虽然已经报道[32]，但是只包含了运动蛋白和外壳蛋白的部分序列，不是全长序列，而且没有对其侵染性进行分析。【拟解决的关键问题】克隆侵染葫芦的CGMMV广东分离物基因组全长，构建其全长侵染性克隆，并测定其对3种重要葫芦科植物（黄瓜、葫芦和西瓜）的致病性，为该病毒的预防提供依据。

1 材料与方法

试验于2018年9月至2019年7月在广东省农业科学院植物保护研究所完成。

1.1 样本来源

2018年9月在广东省连州市葫芦产区发现有植株疑似感染CGMMV，采集2个有症状病样以及1个无症状样品后带回实验室，并置于-80℃超低温冰箱冻存。

1.2 RNA提取

采用TRIzol方法提取样品总RNA，TRIzol购自TaKaRa公司，提取好的RNA样品冻存于-80℃超低温冰箱备用。

1.3 RT-PCR反应

反转录试剂盒购自TaKaRa公司。CGMMV检测引物参考CGMMV序列（GenBank登录号：KX883801）设计，引物序列为F：CCACGAGTTGTTTCCTAAT GCTG/R：TTTGCTAGGCGTGATCGGATTGT，扩增长度为890 bp，退火温度为53℃。

1.4 CGMMV-GDLZ分离物全长序列扩增

将CGMMV全长序列分为两段，前半段1—3 511 nt，后半段3 301—6 423 nt，分别设计引物扩增。前半段扩增引物为F：AAGTTCATTTCATTTGGAGAG GGTTTTAATTTTTATAATTAAACAAA （下划线序列为同源重组序列）/R：AGTTCTGCATTAATTGCTA TTTGGTAGGCACAGTGGTAG；后半段扩增引物为F：GTGCGTGCTACCCCGACTCCAATAGGTTTGAT TGCCCGTG/R：GGTGGAGATGCCATGCCGACCC T GGGCCCCTACCCGGGGAAAGG（下划线序列为同源重组序列）。将扩增好的前半段和后半段序列通过同源重组的方法构建到pCB301载体上[34]。将构建好的pCB301-CGMMV质粒送往上海生工生物工程股份有限公司进行测序。

1.5 系统进化分析

将测序所得CGMMV全长序列在NCBI中进行Blast分析。利用MEGA7软件[35]构建系统进化树。

1.6 CGMMV-GDLZ侵染性克隆构建及农杆菌注射接种

将约为0.5 μg的pCB301-CGMMV质粒转入100 μL GV3101（pSoup）农杆菌感受态细胞（上海唯地生物技术有限公司），菌落PCR验证。将含有pCB301-CGMMV质粒的农杆菌接种于含有卡那霉素（100 μg·mL-1）和利福平（25 μg·mL-1）的LB培养基内，28℃摇床过夜培养，4 000 r/min离心10 min收集沉淀，弃上清，沉淀用农杆菌悬浮缓冲液（10 mmol·L-1MES，10 mmol·L-1MgCl2，150 μmol·L-1As）重悬，利用紫外分光光度计将菌液OD600调至1.0。28℃培养箱静置4 h，用注射器注射植物。

1.7 Western blot检测

采集0.5 g发病及健康对照样品于2 mL离心管中，液氮速冻，通过组织研磨机充分破碎，趁冷加入0.3 mL蛋白提取缓冲液（50 mmol·L-1Tris-HCl pH 6.8，10%甘油，2% SDS，2.5%巯基乙醇），充分振荡混匀，沸水浴10 min，12 000 r/min离心10 min，取20 μL上清进行Western blot检测。Western blot一抗为CGMMV CP多克隆抗体，羊抗兔二抗购自于Sigma Aldrich。

2 结果

2.1 样品采集及检测

2018年9月在广东省连州市一个葫芦种植区调查时发现，部分葫芦植株叶片呈现明显的褪绿、花叶、斑驳等症状（图1-A），疑似感染CGMMV。采集了2株发病植株及1株无症状植株，RT-PCR检测结果显示，2个发病样品均可检测到大小为900 bp左右的特异条带（图1-B），无症状CK样品则没有条带，说明2个发病样品确实感染了CGMMV。

图1 疑似感染CGMMV的葫芦植株田间发病症状以及RT-PCR检测Fig.1 Symptoms of bottle gourd infected by CGMMV and RT-PCR detection of CGMMV

2.2 CGMMV-GDLZ基因组全长序列及其系统进化

为了得到CGMMV广东连州分离物（CGMMVGDLZ）基因组的全长序列，将CGMMV全长分为两段扩增，PCR结果显示，从毒源病样中成功扩增到预期大小的目的条带（未展示数据），将胶回收的片段与pCB301载体[34]进行重组反应，得到CGMMVGDLZ分离物基因组全长序列，同时也构建了其侵染性克隆pCB301-CGMMV。CGMMV-GDLZ分离物全长为6 423 nt（GenBank登录号：MK933286），编码4个蛋白，分别为129K复制酶（61—3 495 nt）、186K复制相关蛋白（61—5 007 nt）、运动蛋白MP（4 994—5 788 nt）和外壳蛋白CP（5 763—6 248 nt）。CGMMV-GDLZ分离物与CGMMV-eWT分离物（GenBank登录号：KY753928）核苷酸同源性最高，为99.97%，仅有第31位和4 143位核苷酸不同，而其编码的所有蛋白的同源性则为100%。

为了分析比较CGMMV-GDLZ分离物与其他分离物之间的关系，利用MEGA7软件[35]构建了系统进化树。选取不同地点（中国大陆、中国台湾、日本、韩国、加拿大、以色列、西班牙、俄罗斯）、不同作物（黄瓜、葫芦、西瓜）上的CGMMV分离物进行系统进化树构建。结果显示CGMMV分离物根据地点分成了3个组：中国大陆、中国台湾、韩国和日本等亚洲国家和地区的CGMMV分离物为第1组；以色列和加拿大CGMMV分离物为第2组；西班牙和俄罗斯CGMMV分离物为第3组。CGMMV-GDLZ分离物与山东黄瓜CGMMV-SD分离物（KJ754195）、河南西瓜CGMMV-hn分离物（KC851866）、浙江香瓜CGMMV-JD8分离物（KM873784）、浙江西瓜CGMMV-DY9分离物（KM873786）距离最近（图2）。

2.3 CGMMV-GDLZ分离物侵染性克隆接种验证

为了验证侵染性克隆pCB301-CGMMV的侵染性，首先利用农杆菌注射的方法接种了本生烟，结果显示第7天时，与Mock植株相比，接种的本生烟上部叶片开始出现明显的泡状凸起，随着时间的发展，症状愈加明显（图3-A）。采集发病叶片进行RT-PCR验证，结果显示发病样品可以检测到CGMMV特异条带，Mock样品没有检测到（图3-B）。进一步利用Western blot进行验证，结果显示发病样品可以检测到CGMMV CP条带，而Mock没有检测到（图3-C）。说明侵染性克隆pCB301-CGMMV具有侵染性。

图2 基于CGMMV全长序列构建的系统进化树Fig.2 Phylogenetic tree based on full-length sequence of CGMMV

图3 利用pCB301-CGMMV侵染性克隆接种本生烟Fig.3 Ago-infiltration into N.benthamiana with pCB301-CGMMV infectious cDNA clones

2.4 CGMMV-GDLZ分离物的致病性

利用含有CGMMV-GDLZ侵染性克隆（pCB301-CGMMV）的农杆菌注射接种黄瓜、葫芦和西瓜的子叶，15 dpi时，葫芦和西瓜上部叶片出现明显的斑驳、花叶、突起，植株生长迟缓，24 dpi时症状更明显；而15 dpi时，CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜上的症状不明显，与未接种对照植株几乎没有区别；将植株从控温接种室移入网室中，30 dpi，黄瓜植株上部叶片开始出现斑驳和花叶，40 dpi时，症状已经非常明显（图4-A）。RT-PCR和Western blot结果验证了CGMMV的成功侵染（图4-B、4-C）。这些结果说明，CGMMVGDLZ分离物可以侵染黄瓜、葫芦、西瓜等瓜类作物，显症时间有所差异。

3 讨论

中国是世界上瓜类种植面积最大的国家，而CGMMV则是危害瓜类作物生产的主要病原菌之一，给我国的瓜类产业造成了巨大的损失。CGMMV属于烟草花叶病毒属[1]，该属病毒可以通过汁液、花粉、农事操作以及嫁接的方式传播，因此CGMMV在田间非常容易扩散。CGMMV还是典型的种传病毒[6-7]，种子带毒也是CGMMV长距离传播的主要方式。

早在2002年和2004年，中国口岸检疫部门就已在从日本进口的瓜类种苗或种子中检测到了CGMMV[36]；2005年，秦碧霞等报道在广西观赏南瓜上检测到了CGMMV，该南瓜品种是从欧洲、印度、日本等国引种后选育出的[22]；2007年，研究人员在从日本引进的西瓜中检测到了CGMMV[37]。对不同国家和地区的CGMMV分离物进行进化树分析，结果显示亚洲的中国、日本、韩国被分到了一组，加拿大和以色列分到了一组，西班牙和俄罗斯等欧洲国家被分到了一组，其中中国与日本的CGMMV分离物在遗传距离上更为接近。这些结果均表明中国大陆的CGMMV很有可能是从日本传播扩散而来。CGMMV-GDLZ分离物在遗传距离上与山东、河南、浙江等地的分离物最接近，说明广东、山东、河南和浙江的CGMMV分离物可能来自相同的传染源。

图4 CGMMV-GDLZ分离物在黄瓜、葫芦和西瓜上的致病性Fig.4 Pathogenicity of CGMMV-GDLZ isolate on cucumber, bottle gourd, and watermelon

接种后15 d，CGMMV-GDLZ在葫芦以及西瓜上的症状已经非常明显，而在黄瓜上的症状却不明显；将黄瓜植株由温度恒定的控温室移入变温的开放网室，30 dpi时黄瓜植株开始出现典型的斑驳和花叶，说明CGMMV-GDLZ在不同作物上的发病时间及发病温度有所差异，这些差异可能与不同的作物和品种有关。不同的作物和品种对同种病毒的抗性有很大的区别，包含抗性基因的作物和品种表现出抗病，反之则表现出感病；另外温度对植物的抗性水平也起着重要的调控作用，在不同的温度下植物表现出不同的抗性水平，比如包含Rychc抗性基因的马铃薯在不同的温度下对马铃薯Y病毒（Potaoto Y virus，PVY）表现出不同的抗性水平，在22℃下马铃薯表现出极端抗性（extreme resistance，ER）水平，只在接种叶上有少量小的坏死斑，上部叶片没有任何症状，而当温度升至28℃时，接种叶上出现了明显的坏死斑，上部叶片也开始有少量发病，另外研究人员还发现包含有Rychc抗性基因的马铃薯栽培品种在夏天比春天更容易出现坏死斑[38]。再如小麦品种Adl-cross在25℃以下对小麦条纹花叶病毒（Wheat streak mosaic virus，WSMV）表现为抗病，而在32℃时则不抗病[39]。这些结果都表明高温可能会降低抗性基因赋予的抗性，使植物在高温下更容易感病。黄瓜以及其他瓜类对CGMMV有没有抗性基因、抗性基因是否受到温度调控还需进一步研究。